高氧诱导R0P模型SD大鼠中循环miRNAs检测分析及相关验证研究

发布时间：2018-03-16 15:47

本文选题：ROP　切入点：高通量测序　出处：《东南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与意义：早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)是主要发生于早产,低出生体重儿的一种可致盲的血管增殖视网膜病,也是世界范围内儿童致盲的主要因素。视网膜新生血管的形成是ROP的主要病理变化,研究已经证实血管内皮生长因子(VEGF)是最强的促血管生成因子,在ROP的发生发展中其表达水平的会发生显著的变化,因此深入探讨研究这些导致视网膜新生血管生成的因子及其调控分子的表达变化对于ROP的研究具有十分重要意义。近年来,microRNA (miRNA)是一类非编码的小RNA,自被发现以后就成为了生物医学领域研究的热点。研究结果表明miRNA作为一种重要的调控分子已经被证实在人类许多疾病的研究中发挥关键性作用。特别最近发现的同样具有重要价值的存在于外周血液中的循环miRNA的表达情况更是受到了临床研究者的重视。因此寻找能够在视网膜血管新生过程中发挥关键作用的调控小分子miRNA及其相关靶基因是ROP进一步深入研究的重要途径。高通量DNA测序技术的飞速发展为相关调节分子的大规模快速筛选提供了可靠的手段,新一代高通量测序技术亦被用于本论文研究中。早产儿视网膜病变的发生率虽然很高,但是从早产儿身上收集足够量以及合适的分析样本确实非常困难的事情。因此实验动物的研究是ROP相关疾病研究的必经之路,ROP新生大鼠/小鼠模型的构建方案已经比较成熟,本研究也不例外的应用模型大鼠来进行相关的实验与分析。ROP的致病因素很是复杂,至今也没有完全研究清楚,但是早产儿吸氧已被证实是导致视网膜血管新生的主要因素,从而成为ROP的主要的致病原因之一,因此本论文研究的主要实验对象即为高氧诱导的ROP模型SD大鼠。综述所示,本论文研究拟利用高通量测序手段系统全面的分析高氧诱导的ROP模型SD大鼠血浆样本以及视网膜组织中miRNA的差异表达情况,随后通过验证及其调控靶目标表达水平的检测分析,探索导致ROP产生的深层次的分子机制以及对ROP诊断治疗具有潜在价值的生物分子进行系统的评估。论文研究的主要成果如下：方法与结果1)ROP模型SD大鼠的构建及其血浆循环miRNA的高通量测序筛选论文研究首先选择新生SD大鼠进行高氧环境刺激,构建ROP模型,然后通过视网膜血管形态及增生情况进行模型动物构建成功与否的评价；随后收集模型组和对照组外周血液样本,分离血浆,制备模型组和对照组pool样本,提取RNA,质控后进行文库构建和Illumina HiSeq 2500的高通量测序。实验结果显示：1)本研究中构建的ROP模型SD大鼠视网膜病变特征明显,显示视网膜血管发育滞缓,管径变细,分支减少而且有明显扩张迂曲,大量新生血管形成,血管密度增高,HE染色切片有很多的突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核,ROP模型鼠构建成功；2)高通量miRNA测序结果显示在模型鼠与对照鼠血浆中存在一些具有显著性差异表达的miRNA,经过严格的筛选共获得上调的miRNA22种,下调的miRNA44种,所有后续深入研究涉及的miRNA将主要来源于此。此外在测序结果中发现存在5p和3p共表达的miRNA中,其表达水平的比值亦存在一定的规律性,ROP模型组与对照组之间5p/3p的比值存在一定的差异,提示其具有进一步研究的潜在价值。2)ROP模型鼠视网膜组织miRNA的高通量筛选为了更加全面的了解循环miRNA与特定疾病的关系,模型鼠视网膜组织也被同时收集起来并提取RNA,进行了高通量芯片筛选与生物信息分析,以期与血浆中循环miRNA的表达情况进行对比分析,更为确切地寻找ROP特异性的miRNA分子。芯片检测结果显示ROP模型组与对照组之间存在一些差异表达的niRNA,进一步严格其筛选条件后获得了13种上调的]miRNA和14种下调的miRNA,这些miRNA的靶基因功能富集显示其可能与对低氧的反应等相关的GO功能及调控通路有关,为进一步分析研究血浆中miRNA的差异表达情况提供了重要的参考。3)循环niRNA差异表达情况的分析、验证与部分相关基因功能的研究差异表达miRNA的筛选不是最终目标,其确切的功能及其在ROP中可能的作用机制才是论文研究的主要目标,因此初步筛序获得的循环miRNA进行了进一步的生物信息分析,包括靶基因预测,GO功能富集和KEGG调控通路分析。针对前期测序和后续生物信息分析的结果,部分差异表达的miRNA进行了定量PCR的验证；同时检测了相关的靶基因在模型组和对照组之间的mRNA和蛋白水平的表达差异。还针对个别靶基因VEGF和GABA与miRNA的关联进行了深入的分析与探讨,VEGF与 GABA均已被证实与ROP发生发展过程中缺氧环境有关。最后通过比较分析视网膜组织和循环miRNA的差异表达情况,筛选出来4种具有共表达趋势的miRNA,并且在早产儿病例中进行了定量PCR验证分析。本部分研究结果如下：1)筛选出其中10种包含有高丰度表达、低丰度表达、高差异倍数、低差异倍数以及上调和下调的miRNA的表达情况都在定量PCR的验证结果中得到了证实,三种miRNA 5p/3p的比值也在对应的分析中发现与测序结果一致；2)生物信息分析结果发现经过严格条件筛选的14种miRNA利用两种靶基因数据库预测能够获得594种共同的靶基因,对这些靶基因进行GO功能富集和KEGG分析发现,大多数都参与胚胎发育、细胞的形态变化、细胞移行、细胞的运动、细胞生物合成等且于血管新生密切相关的过程,同时还参与了细胞因子、神经营养因子、趋化因子以及MAPK和TGF-β的信号调节通路的正向调控,细胞间的细胞传递等；3)血浆VEGF和血浆GABA的水平分析发现,miRNA参与了这些关键的靶基因的表达调控,而且它们之间存在着相互协调、相互制衡的复杂关系,其中诸如miR-351、miR-200b等就共同靶向VEGF与GABA,提示这些miRNA可以作为潜在的ROP的治疗靶点进行进一步的深入研究和探索；4)视网膜组织与血浆共表达的niRNA在3例早产儿视网膜病变中得到了证实,在另外两例中发现了一些不一致现象,其中一例伴有先天性心脏病,因此提示这些差异表的miRNA可能还同时参与了先天性心脏病等相关疾病的调节控制。结论：综上所述,本论文研究利用高通量测序手段获得了一些差异表达的miRNA,部分miRNA在定量PCR中获得了证实；这些miRNA参与调控的与ROP密切相关的靶基因的表达情况也在论文中进行了研究与探讨；与视网膜组织相比较发现了一些共表达的miRNA,这些miRNA在几个典型的早产儿视网膜病变病例中得到了验证。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1;R-332

【参考文献】