丛生蛋白作用下人视网膜色素上皮细胞中小RNA及长链非编码RNA表达差异研究及功能性分析

发布时间：2018-11-03 21:46

【摘要】：研究背景及目的:AMD (age-related macular degeneration,年龄相关性黄斑变性)其临床特点之一是玻璃膜疣的形成。RPE (retinal pigment epithelial,视网膜色素上皮细胞)是AMD研究的核心细胞。玻璃膜疣的重要组份之一——CLU(clusterin,丛生蛋白)能保护RPE细胞免受氧化应激所致凋亡。体内非编码RNA中具有重要功能的包括 miRNA (microRNAs,小 RNA)和 lncRNA (long noncoding RNAs,长链非编码RNA)。这两者均参与了体内基因表达修饰及调控过程。然而,在CLU作用下的RPE细胞中,其下游特定的miRNA及lncRNA出现怎样的改变,目前尚不清楚。希望通过本研究阐明CLU对RPE细胞稳定性的影响,观察CLU作用下RPE细胞中mRNA、miRNA及lncRNA差异表达变化,构建lncRNA-mRNA-miRNA基因调控网络进行功能性验证和分析。方法·①MTT法检测CLU作用下人RPE细胞株D407细胞稳定性。②高通量测序法检测CLU作用下D407细胞中mRNA、miRNA及lncRNA表达差异。③构建lncRNA-mRNA-miRNA相关基因调控网络,筛选目标靶基因并对其进行验证。④建立Aβ25-35诱导的RPE细胞毒性模型,采用Western blot和RT-PCT的方法研究目标靶基因hsa-miR-1273g-3p参与AMD可能的发病机制。结果:①CLU的任一浓度和时间均不会给D407细胞的活力和增殖带来负面作用,也不影响RPE细胞的生存力。②mRNA、miRNA及lncRNA表达差异检测结果:经CLU处理后RPE细胞中总共有321个基因表达呈现差异,其中有71个基因表达升高,250个基因表达降低;有36个miRNA呈现异常表达。与对照组对比,经CLU处理后的实验组中共检测出296个已知lncRNA和90个新发现的lncRNA。经分析,共有66对差异表达的miRNA-mRNA。其中大部分是多个目标靶基因与一个miRNA相对应,个别是一个目标靶基因只与一个miRNA相连的单一对应关系。③构建ceRNA基因网络:筛选出代表性差异基因并对其进行了验证,包括:靶基因EN(engrailed,同源盒蛋白转录因子)1、EN2、EDN2(endothelin2,人内皮素2)、MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein,肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白)和 C5AR2 (complement component 5areceptor 2,补体成分 5a 受体 2 基因);lncRNA NR_036461 (HIST2H2BC)和 NR_02376 (TOPORS-AS1) ; miRNA hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-5582-3p 和 hsa-miR-1293。其中,hsa-miR-1273g-3p 与炎症反应密切相关。④建立Aβ25-35诱导的RPE细胞毒性模型,发现hsa-miR-1273g-3p能调控Aβ25-35寡聚体诱导的RPE细胞毒性模型中炎症反应相关因子如 MMP-2 (matrixmetalloproteinase-2,基质金属蛋白酶 2)、MMP-9 和 TNF-α(tumour necrosis factor α,肿瘤坏死因子αα)的基因转录和蛋白表达水平,hsa-miR-1273g-3p能调控自体吞噬相关蛋白酶的表达,从而调控溶酶体介导的自体吞噬途径,进而参与AMD发生机制。结论:本研究分析了 CLU作用下RPE细胞中mRNA、miRNA及lncRNA差异表达变化,筛选出代表性差异表达基因并进行了验证。其中最重要的与炎症反应相关的基因是hsa-miR-1273g-3p。通过建立Aβ25-35诱导的RPE细胞毒性模型,首次研究了 hsa-miR-1273g-3p参与AMD发生及RPE细胞损伤机制,这为进一步研究AMD发病机制及探求新的治疗靶点提供了理论基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R774.5

【参考文献】