FTY720对糖尿病视网膜病变的治疗作用及其机制研究

发布时间：2018-11-08 14:02

【摘要】：研究背景:近年随着人们饮食结构及生活方式的改变,糖尿病(diabetic mellitus,DM)患者的人数逐年攀升,糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的发病率也随之急剧增长,成为工作年龄组人群的主要致盲原因之一。目前DR发病机制尚不明确,其中炎症反应成为近年来的研究热点,在DR的发生及发展中起到了重要作用,表现为促炎性细胞因子和粘附分子表达增加、白细胞瘀滞,进而导致血视网膜屏障(blood retinal barrier,BRB)破坏。FTY720是一种通过冬虫夏草中提取的有效成分多球壳菌素结构改造而合成的新型免疫抑制剂,主要通过结合细胞表面的鞘氨醇-1-磷酸受体(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR)发挥作用。目前研究表明,FTY720对多种免疫相关性疾病及心血管疾病治疗有效,但其对大鼠DR是否具有治疗作用尚不清楚。另外,内皮细胞表面主要表达S1P1和S1P3,二者在维护血管完整性方面发挥重要作用。但是,S1P1/S1P3是否参与DR的发病,且FTY720是否可以通过调节视网膜S1P1/S1P3保护DM大鼠BRB尚不清楚,需要进一步探讨。目的:(1)探讨FTY720对大鼠DR是否具有治疗作用,包括炎症抑制和保护BRB两个方面;(2)探讨视网膜S1P1/S1P3是否参与DR的发病;(3)探讨FTY720是否可以通过直接调节视网膜S1P1/S1P3发挥保护BRB的作用。方法:(1)雄性Wistar大鼠45只,随机分为正常对照组(control组,n=15)和DM组(n=30)。DM组大鼠通过一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotozin,STZ,60mg/kg)建立DR模型。DM模型建立成功后,分别于病程4周、8周和12周检测各组大鼠体重及空腹血糖;分别于病程4周、12周处死DM组大鼠各15只,12周处死所有control组大鼠,并取材用于相关实验。采用苏木精-伊红(HE)染色,观察各组大鼠视网膜的组织病理学改变;采用伊文思蓝(Evens Blue,EB)灌注血管造影视网膜铺片,观察视网膜血管渗漏情况;采用Western blot检测视网膜VEGF表达。(2)雄性Wistar大鼠150只,通过一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)建立大鼠DR模型。DM模型建立成功后,将DM大鼠随机分为DM组和FTY720干预组(DM+FTY720组),正常大鼠用作对照(control组),每组各50只。DM+FTY720组大鼠每天灌胃给予FTY720,1次/天,剂量为0.3mg/kg,持续12周。分别于4周、8周和12周,检测各组大鼠体重及空腹血糖水平。12周后,所有大鼠均处死并用于相关实验。采用HE染色,观察各组大鼠视网膜的组织病理学改变;采集外周血检测淋巴细胞数量;采用Western Blot法检测视网膜组织炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达情况;采用FITC标记的刀豆素蛋白(Con A)灌注染色检测视网膜血管内白细胞粘附情况,并在共聚焦荧光显微镜下计数粘附的白细胞数目;采用Western Blot、免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测视网膜细胞间粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的分布及表达;采用Western Blot和RT-PCR检测视网膜组织中NF-κB(p65)的表达;采用免疫荧光染色检测视网膜炎性细胞浸润情况,包括CD45阳性的全部白细胞、CD11b阳性的巨噬细胞/活化小胶质细胞和CD3阳性的淋巴细胞;采用EB灌注血管造影视网膜铺片,观察视网膜血管渗漏情况,并定量检测视网膜血管渗漏量;采用Western Blot和免疫组织化学染色检测视网膜紧密连接蛋白的分布及表达情况,包括ZO-1,Occludin和Claudin-5;采用RT-PCR检测视网膜S1P1和S1P3的m RNA表达水平。结果:(1)DM组大鼠各时间点空腹血糖明显升高,而体重显著下降。HE染色显示DM组大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,细胞核疏松,且病程12周时视网膜神经节细胞层可见空泡样变性及部分血管扩张;EB灌注血管造影视网膜铺片显示,DM4周时视网膜血管可见少量荧光渗漏,12周时可见大量弥慢性荧光渗漏;与正常大鼠相比,DM组大鼠视网膜VEGF表达显著增加,且DM12w组显著高于DM4w组。(2)DM组与DM+FTY720组大鼠各时间点空腹血糖明显升高,而体重显著下降;HE染色显示,DM组大鼠视网膜厚度变薄,各层细胞排列紊乱、边界不清,细胞核肿胀、体积增大,可见部分血管扩张;FTY720治疗后DM大鼠视网膜厚度增加,各层细胞排列逐渐恢复正常,细胞核肿胀减轻;外周血检测结果表明,DM+FTY720组大鼠外周血淋巴细胞数目较DM大鼠显著减少;与正常大鼠相比,DM大鼠视网膜组织中TNF-α、IL-6和IL-1β表达显著增加,而DM+FTY720组大鼠三者表达均较糖尿病组显著下降;FITC-Con A灌注染色显示,DM大鼠视网膜血管中有大量白细胞粘附且血管分叉处多见,而DM+FTY720组大鼠视网膜血管中偶尔可见少量白细胞粘附;白细胞粘附计数结果表明,DM+FTY720组大鼠视网膜血管粘附的白细胞数目较DM组显著减少,;免疫组织化学染色显示,DM大鼠视网膜组织中有大量ICAM-1和VCAM-1阳性细胞且主要分布在神经节细胞层及神经纤维层,而DM+FTY720组大鼠视网膜组织中仅有少量阳性细胞分布;Western blot和RT-PCR检测表明,在蛋白及m RNA水平上,DM大鼠视网膜组织中ICAM-1和VCAM-1的表达均较正常大鼠显著增加,而DM+FTY720组大鼠视网膜组织中两者的表达均较DM组显著减少;Western blot和RT-PCR检测表明,在蛋白及m RNA水平上,DM大鼠视网膜组织中NF-κB(p65)的表达较正常大鼠显著增加,而FTY720治疗可以显著下调其表达;免疫荧光染色显示,DM大鼠视网膜组织中有大量CD45阳性的白细胞浸润,包括CD11b阳性的巨噬细胞/活化的小胶质细胞,而DM+FTY720组大鼠视网膜组织中仅有少量CD45和CD11b阳性细胞,三组大鼠视网膜中均未见明显的CD3阳性T细胞;EB灌注血管造影视网膜铺片显示,DM大鼠视网膜血管有明显的荧光渗漏,而DM+FTY720组大鼠视网膜血管仅可见局部少量渗漏;视网膜EB渗漏定量分析表明,DM大鼠视网膜血管渗漏量显著高于正常大鼠,而DM+FTY720组大鼠视网膜血管渗漏较DM大鼠显著减少;免疫组织化学染色显示,正常大鼠视网膜组织有大量ZO-1、Occludin和Claudin-5阳性细胞且主要分布于神经纤维层、神经节细胞层、内核层及外从状层,DM大鼠视网膜组织中仅可见少量阳性细胞,而DM+FTY720组大鼠视网膜组织中三种阳性细胞分布较多;Western blot检测表明,DM大鼠视网膜组织ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达均较正常大鼠明显减少,而DM+FTY720组三者表达均较DM大鼠显著增加;RT-PCR结果显示,m RNA水平上正常大鼠视网膜组织中有大量S1P1和S1P3表达,DM大鼠视网膜中两者表达均较正常组减少,而DM+FTY720组两者表达较均DM大鼠显著增加。结论:(1)FTY720可以抑制DM大鼠视网膜炎症反应,并保护视网膜血管完整性;(2)DM大鼠视网膜组织中S1P1/S1P3的下调可能参与了BRB破坏;(3)FTY720通过两种机制发挥保护BRB的作用,一种是抑制炎症反应,另一种是直接上调视网膜组织中S1P1/S1P3表达。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R774.1

【参考文献】