兔眼高速枪弹伤模型及伤后谷氨酸变化的实验研究

发布时间：2018-11-16 18:01

【摘要】：研究背景：随着我国生活水平的提高、工业自动化进程的加速、交通事故和自然灾害的频发,眼球钝挫伤的发生率不断上升,且成为伤后造成患者视功能受损、视力丧失,成为影响生活质量的重要原因之一。高速物体所致的眼挫伤在车祸及战伤中极其常见,即便没有合并眼球穿孔伤,也往往导致伤后严重的视功能障碍。因此这成为了广大医学工作者和实验研究人员所关注的热点。眼球挫伤(Contusion of eyeball)是指钝形物体的直接打击或高压液体及气体对眼球的冲击引起的眼部损害,但不引起眼球壁破口,也称为眼球非穿孔伤,是最常见的眼外伤。这种损害可以是对打击部位的直接损伤,也可以是作用力通过眼内容物的传导,引起的打击对应部位甚至整个眼球的损伤。损伤后,常见有：组织损伤引起的即刻生理障碍,血管反应所引起的组织变化；严重者可导致眼内组织机械性撕裂和断裂。因此,国内外学者通过制备动物模型来研究眼球钝挫伤的损伤机制,国内研究多选择实验兔,使用重力致伤、冲击致伤等方法制备实验动物模型；国外则多选用实验猪、鼠等建立模型,检测对比损伤前后各组织的病理变化和生化因子,制定观察指标。研究中致伤的轻、重分级多以能量为标准。致伤后多从以下方面进行分析：组织病理切片分析；基于细胞分子水平的实验研究：视网膜抗氧化酶类变化、用放射免疫法测定伤眼视网膜及脉络膜免疫活性内皮素(Immunoreactive-endothelin, ir-ET)的水平、视网膜神经生长因子(NGF)和勿动蛋白(Nogo)检测、视网膜神经生长因子(NGF)和酪氨酸激酶A (TrkA)在视网膜神经细胞中的表达；此外在急性视神经挫伤的实验中,通过采取各种干预措施抑制神经元凋亡以保护视网膜神经节细胞(RGCs, Retinal Ganglion Cells),可提高受损RGCs的存活率,有望为RGCs的再生创造条件。在哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS)中,谷氨酸是最主要的兴奋性神经递质,过量外源性谷氨酸将产生兴奋性神经毒性,还可通过抑制细胞膜上谷氨酸转运体产生细胞毒性作用,该途径被称为谷氨酸的氧化毒性(Oxidativetoxicity),已经证实许多中枢神经系统疾病均与谷氨酸代谢异常有关,其对神经细胞具有损伤作用。为保持突触传递的敏感性,谷氨酸必须被及时清除。早在1981年,Costman等提出在中枢神经系统中,谷氨酸能神经元与神经胶质细胞之间可能存在着谷氨酸-谷氨酰胺循环。谷氨酸储存在突触前小囊泡中,通过钙离子依赖性的出胞作用被释放到突触间隙,和突触后膜上的离子型或代谢型谷氨酸受体结合后,从而激活与其相偶联的钠、钙离子通道或G蛋白,产生兴奋性冲动。而未与受体结合的谷氨酸通过另外两条途径转运：重新被摄取回突触前囊膜；扩散至突触间隙被神经胶质细胞摄取后,在谷氨酰胺合成酶作用下转化为谷氨酰胺,神经元细胞摄取了谷氨酰胺后经谷氨酰胺酶转化为谷氨酸,并转运到突触前囊泡中完成循环。此为中枢神经系统的谷氨酸-谷氨酰胺循环学说。所以在谷氨酸-谷氨酰胺循环中的任一环节的障碍,均可能导致与谷氨酸兴奋性毒性作用有关的神经性眼病。而眼钝挫伤后,细胞膜的受损及各种代谢途径的紊乱均可从不同途径引发谷氨酸的堆积而引起神经毒性损伤。随着高速公路上车祸的增多,为了贴近生活及临床上眼外伤的实际情况,本实验研究采用子弹(可忽略质量)枪击伤兔眼,设计以高速为首要致伤因素,模拟高速小质量物体致人眼重伤情况,重点观察高速这个因素影响下,兔眼眼前节组织、视网膜、玻璃体腔中重要神经兴奋性氨基酸(谷氨酸)的变化、谷氨酸与视网膜损伤的相关性以及谷氨酸-谷氨酰胺相关性分析,初步描述此种致伤模型的致伤效果,为临床研究高速物体致眼钝挫伤的早期救治提供参考,实现最终将研究成果进行转换,用于提高临床诊疗水平。目的：通过分析高速枪弹伤后兔眼眼前节组织、视网膜、玻璃体腔中重要神经兴奋性氨基酸(谷氨酸)的变化、谷氨酸与视网膜损伤的相关性以及谷氨酸-谷氨酰胺相关性分析,研究验证低能量高速可致严重眼外伤,进一步证实高速因素在眼外伤中的至关重要。因而为以后及时的临床治疗及防护提供新的思路。方法：健康2月龄新西兰兔54只,清洁级,自由摄水摄食,本院(南京军区总医院)动物实验中心提供,体重2.0-3.0kg,雌雄不限,其中18只致双眼伤,18只致单眼(左眼)伤,18只为对照眼,不处理。实验兔以盐酸氯胺酮按25mg/kg肌注麻醉后,侧卧于实验台上,开睑器牵开眼睑,用汽步枪以90m/s的速度射发TB弹(平均重量0.20122g)距实验动物眼前1cm击中角膜中央区,以同等质量、相同速度、同等距离打击实验动物眼部,成批制成眼球钝挫伤动物模型。制伤后实验兔及对照兔分别于3h,6h,1d,3d,7d,14d,以相同方法处死九只实验兔后,用巩膜穿刺刀在角巩膜缘后3mm行巩膜穿刺切口,18号无菌针头自切口伸入玻璃体腔内抽取0.5ml玻璃体,迅速置于低温冰箱(-80℃)保存备用。将眼球用4%甲醛全眼固定后当天处理。玻璃体样本乙腈去蛋白离心后,取上清液1μl,用高效液相色谱仪分析其中谷氨酸、谷氨酰胺浓度。甲醛固定眼球进行全眼纵向切开,经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片做常规HE染色检查。采用SPSS13.0软件进行统计分析,定量资料采用例数、均数、标准差表示。多独立组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间均数差别的两两比较,若方差齐性,采用LSD检验,若方差不齐采用Dunnett T3检验。p≤0.05表示差别具有统计学意义。结果：所有实验兔眼未见破裂,致伤后球结膜水肿逐渐加重,第3天开始缓解；角膜损伤严重,雾状混浊2周后才稍有好转,同时,周边可见大量新生血管长入；前房可见大量新鲜出血,实验结束时仍未吸收；瞳孔呈外伤性散大,10只实验兔眼出现不可逆的瞳孔变形；晶体浑浊。光镜下：对照组兔眼层次结构清晰,感光细胞内外节排列整齐,色素上皮层连续、规则。伤后3h：视网膜组织水肿,内核层细胞间水肿为主,神经节细胞层细胞数量稀少,内界膜破损,光感受器层内节间结构疏松、紊乱,色素上皮层水肿,可见局限性渗出性视网膜脱离。脉络膜出现色素细胞变性,结构紊乱。伤后6h：视网膜组织水肿进一步加重,内界膜连续性中断,内核层有较多的空泡变性,排列不规整,外核层细胞结构紊乱,光感受器层外节结构紊乱,膜盘碎裂,碎片散布于内节和色素上皮细胞之间。色素上皮层连续性断裂,部分细胞破碎。伤后1d：神经节细胞层、内核层、外核层细胞数量均明显减少,光感受器层细胞内节尚完整,光感受器层细胞外节碎裂、变短、排列紊乱。色素上皮层出现局限性细胞溶解,部分区域缺如。伤后3d：外核层和内核层细胞数量减少、结构紊乱,内、外丛状层正常结构消失,光感受器细胞层内外节断裂,显微组织崩解,色素上皮层结构基本消失。伤后7d：视网膜水肿仍继续加重,内核层和外核层结构混淆、紊乱,脉络膜小血管基本消失,血管中可见血液淤滞,大量红细胞堆积。伤后14d：视网膜正常结构基本消失,出现脉络膜脱离,脉络膜血管管壁弹性下降。玻璃体腔内谷氨酸浓度：兔受到高速枪弹伤后实验眼玻璃体谷氨酸浓度较对照眼显著增高；方差分析显示三组样本之间6h、3d、7d、14d谷氨酸含量有差异(P=0.039、P=0.024、P=0.038、P=0.041)；由于方差齐,使用LSD检验,左伤眼组与对照组间在6h、3d、7d、14d谷氨酸含量有统计学差异(P=0.021、 P=0.014、P=0.018、P=0.033),双眼伤组与对照组在6h、3d、7d、14d谷氨酸含量有统计学差异(P=0.030、P=0.015、P=0.037、P=0.022),而左伤眼组与双眼致伤组中谷氨酸含量在各时相点差异不显著(P0.05)；左伤眼组与双眼致伤中谷氨酸含量在各时相点间差异有统计学意义(P=0.046、P=0.026),对照组中谷氨酸含量在各时相点差异无统计学意义(P=0.217)。玻璃体腔内谷氨酰胺浓度：兔受到高速枪弹伤后实验眼玻璃体谷氨酰胺浓度较对照眼显著增高；方差分析显示三组样本之间6h、1d、3d、7d、14d谷氨酰胺含量有差异(P=0.044、P=0.039、P0.001、P=0.003、P=0.049);由于方差齐,使用LSD检验,左伤眼组与对照组间在6h、1d、3d、7d、14d谷氨酰胺含量有统计学差异(P=0.017、P=0.014、P0.001、0.002、P=0.002、P=0.024),双眼伤组与对照组在3d、7d、14d谷氨酰胺含量有统计学差异(P0.001、P=0.003、P=0.046),而左伤眼组与双眼致伤中谷氨酰胺含量在各时相点差异不显著(P0.05)；左伤眼组和双伤眼组各时相点间存在差异(P=0.043、P=0.001),对照组各时相点间差异无统计学意义(P=0.160)。结论：本研究证实了高速枪弹可致眼球各结构及屈光介质严重损伤,视网膜损伤程度较重,眼挫伤能导致玻璃体谷氨酸浓度的增高,反映了视网膜突触间隙谷氨酸量的增加,并随着时间的延长不断上升,可推测神经兴奋性氨基酸是增加视网膜结构损伤的因素之一,且视网膜超微结构的破坏又进一步加重了谷氨酸及谷氨酰胺的含量,从而形成恶性循环,使得眼外伤后视力不可逆损伤,导致严重视力障碍。因此高速对眼外伤的影响至关重要。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R779.1

【参考文献】