NF-κB与HIF-1在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征发病中的作用研究

发布时间：2018-11-19 11:21

【摘要】：睡眠呼吸暂停低通气综合征(sleep apnea-hypopnea syndrome, SAHS)是一种全身性疾病,主要表现为打鼾、呼吸暂停、夜间反复低氧血症、高碳酸血症和睡眠结构紊乱,以及白天嗜睡,多系统并发症。以慢性缺氧／再氧合为病理生理基础。分为阻塞性、中枢性、混合性,以阻塞性为主(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)。成年人中发病率达2%-4%。,与高血压、冠心病、心律失常、充血性心力衰竭、脑血管病、老年痴呆、肺动脉高压、肺心病、哮喘、肝肾功能损害、胰岛素抵抗、多囊卵巢综合征、妊娠期高血压、听力损害、阳萎等有关。该病的发病机制尚未明确,尤其是关于OSAHS合并心脑血管疾病的发病机制未有定论,因而成为当前的研究热点。研究结果显示OSAHS合并心脑血管疾病发病机制主要有如下几方面：交感神经兴奋、氧化应激、炎症反应、血液的高凝状态、内皮功能的受损、胸内压的改变、内分泌及代谢异常等。OSAHS的病理生理基础为慢性间断缺氧,这也是引起血管内皮受损的核心环节。研究较多的其中两条通路使得研究OSAHS合并心血管疾病有了新的进展。间断缺氧的病理生理基础使得OSAHS的发病机制可能存在着两条通路：核因子-κB(NF-κB)依赖的炎性通路产生的炎症细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、选择素)促使炎症反应形成动脉粥样硬化；和低氧诱导因子-1(HIF-1)依赖的适应性通路产生EPO、iNOS、VEGF等促进血管内皮细胞的增生、血管通透性的增加及新生血管的形成。核因子-κB(NF-κB)是一种与许多基因启动子上κB序列(GGG ACT TTC)特异性结合而启动基因转录功能的蛋白。在免疫应答、炎症反应、细胞分化和生长、细胞黏附和凋亡等方面发挥着重要作用。在非激活状态下,NF-κB与IκB非共价结合形成复合物,在胞浆内以无活性的二聚体形式存在。当活化信号(TNF-α、LPS、氧化剂、氧自由基、放射线、紫外线、病毒及其代谢产物等)暴露时,NF-κB与IκB解离,促使NF-κB活化,活化的NF-κB进入核内,结合至DNA反应元件启动子,激活炎症基因的转录,诱导细胞因子、粘附分子、血管活性调节因子上调,进一步使得下游细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MMP-9、IACM-1、VCAM-1)浓度升高。因此NF-κB参与炎症反应的启动。低氧诱导因子-1(HIF-1)是一种特异性地结合于低氧反应元件的蛋白,由两个亚单位组成：a、D。HIF-α是低氧诱导的。HIF-1是氧平衡调控的转录因子,使缺氧的组织细胞能保持氧稳态以耐受缺氧状态,低氧时在组织细胞中广泛表达。常氧下,HIF-lα、HIF-1p均构建型表达,HIF-1无DNA结合活性,低氧可诱导HIF-1α蛋白水平和HIF-1DNA结合活性增加。缺氧刺激下,HIF-1α表达水平增加,与HIF-1β形成稳定的二聚体,进入细胞核,与低氧反应元件结合,促进转录,使得下游的EPO、VEGF、iNOS、ET-1、COX、IGFBP-1等增加,从而参与器官或组织的缺氧缺血性损伤及其修复过程。研究证实间歇低氧激活的炎症通路在OSAHS并发心脑血管疾病中起着重要作用,血液中的单个核细胞尤其CD8+T细胞是重要的炎症细胞,它作用于血管内皮细胞,致使内皮功能受损进一步形成粥样斑块。但炎症反应相关的上述两条通路与OSAHS发病的相关性尚存争议：多数学者认为该炎症通路主要由NF-κB调控；也有学者发现HIF-1依赖的适应性通路也可被间歇低氧诱导；其中HIF-1依赖的适应性通路能否在间断缺氧的情况下被激活是分歧所在。大部分研究认为持续低氧激活了HIF-1依赖的适应性通路,而间歇低氧只激活了NF-κB依赖的炎症通路。在慢性持续缺氧性疾病COPD发病中,已有文献证实与NF-κB、HIF-1均有关系,且HIF-1可能通过活化NF-κB对COPD疾病的发展起作用。为了明确两通路与间断缺氧性疾病OSAHS发病的相关性,研究在间歇低氧、持续低氧的环境下,两条通路可能出现的不同的表达情况,我们通过测定OSAHS(旬歇低氧)、COPD(持续低氧)患者与对照组的外周血单个核细胞(PBMCs)中NF-κB、HIF-1的基因和蛋白表达情况,以探讨两者在OSAHS发病机制中的作用。目的：通过测定外周血单个核细胞的NF-κB、HIF-1mRNA水平和NF-κB、HIF-1蛋白水平,观察NF-κB依赖的炎性通路与HIF-1依赖的适应性通路的激活情况,探讨NF-κB与HIF-1在OSAHS发病中的作用及两者对OSAHS疾病严重程度的影响。方法：研究对象分为4组：轻中度OSAHS组、重度OSAHS组、COPD组、对照组。所有患者均接受多导睡眠监测。OSAHS组及对照组为2010年10月至2011年8月在广东省人民医院东病区医学睡眠门诊就诊的患者；COPD组来源为2010年10月至2011年8月在广东省人民医院呼吸科门诊就诊的稳定期患者,入组后行动脉血气分析。排除标准：自身免疫性疾病、使用免疫抑制剂或细胞毒类药物者、恶性肿瘤、急性感染性疾病、急慢性肾功能衰竭、严重精神障碍、肺叶切除术、其他长期慢性缺氧疾病等。入选标准：按2003年中华医学会呼吸病学分会睡眠呼吸疾病学组制定的OSAHS诊断标准,AHI30次/h为轻中度OSAHS组,AHI30次/h为重度OSAHS组；按2007年中华医学会呼吸病分会制定的慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)中稳定期COPD的诊断标准。对照组无COPD及OSAHS,并无排除标准中相应疾病,在性别、年龄、疾病构成等一般资料上与轻中度OSAHS、重度OSAHS、COPD组相匹配。基因研究组入选轻中度OSAHS组16例(轻度12例,中度4例),重度OSAHS组14例,COPD组30例,对照组30例。蛋白研究组入选轻中度OSAHS组11例(轻度8例,中度3例),重度OSAHS组13例,COPD组14例,对照组14例。其中COPD组入组后均行动脉血气分析。所有对象在行PSG检查后的次晨6时,空腹抽取外周静脉血8ml,注入肝素钠抗凝管待行单个核细胞分离。采用Ficoll密度梯度法分离PBMCs。分别用实时荧光定量PCR法及Western blotting检测两活性亚基NF-κB P65、HIF-1α的基因和蛋白表达。用Trizol一步法抽提PBMCs中总RNA,实时荧光定量PCR法检测nRNA表达水平。目的基因的相对表达量为2-ΔCT(ACT=目的基因CT值-内参基因CT值)。提取PBMCs核蛋白,BCA法测定蛋白浓度,变性后以每孔30μg蛋白上样,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,目标一抗(abcam,美国小鼠抗人NF-KB P65稀释浓度为1：250,HIF-lα稀释浓度为1：400)及内参一抗(GAPDH稀释浓度为1：5000)分别孵育过夜,二抗(Merck,美国羊抗小鼠稀释浓度为1：10000)室温孵育1h。增强化学发光剂(ECL)显影PVDF膜,压片曝光。胶片以ImageScanner扫描后,用FluorChem8900欢件对图片条带面积和灰度值进行分析,以NF-κB P65、HIF-1a与内参GAPDH条带的比值代表相对表达水平。结果： 1.研究对象一般资料基因研究组：轻中度OSAHS组患者16例(轻度12例,中度4例),其中男13例,女3例,年龄42-76岁,平均62.1+9.7岁,合并冠心病3例,AHI=11.8±5.3,BMI24.7±3.3kg/m2；重度OSAHS组患者14例,其中男11例,女3例,年龄41-73岁,平均61.6±9.5岁,合并冠心病4例,AHI=49.4±18.9,BMI25.2±2.9kg/m2；COPD组共30例,其中男23例,女7例,年龄55-75岁,平均66.5±5.0岁,合并冠心病10例,FEV1%pred43.72±13.51%, SaO293.58±2.88%, AHI=2.1±1.4, BMI23.4±1.5kg/m2;对照组共30例,其中男22例,女8例,年龄46-75岁,平均63.3+7.5岁,合并冠心病12例,AHI=2.6±1.3,BMI23.6±2.5kg/m2。蛋白研究组：轻中度OSAHS组11例(轻度8例,中度3例),其中男9例,女2例,年龄42-70岁,平均58.3±7.6岁,合并冠心病2例,AHI=12.0±5.9, BMI25.4±3.4kg/m2;重度OSAHS组患者13例,其中男10例,女3例,年龄41-73岁,平均57.1±12.1岁,合并冠心病4例,AHI=48.4±19.3,BMI25.1±3.0kg/m2；共14例COPD稳定期患者入组,其中男12例,女2例,年龄55-72岁,平均64.4±4.6岁,合并冠心病7例,FEV1%pred43.61±13.47%, SaO293.44±2.32%, AHI=2.1±1.3; BMI23.0±1.6kg/m2;对照组共14例,其中男12例,女2例,年龄46-72岁,平均59.9±8.0岁,合并冠心病6例,AHI=3.1±1.2,BMI24.0±2.2kg/m2。基因研究组及蛋白研究组对象在性别、年龄、疾病构成等临床资料方面均无统计学差异(P均0.05),资料具可比性。 2.各组NF-κB基因及蛋白的表达 2.1各组NF-κB基因表达轻中度OSAHS组、重度OSAHS组、COPD组、对照组NF-κB P65mRNA表达分别为(0.007±0.005)VS(0.029±0.042)VS(0.013±0.010)VS(0.004±0.003),总体差异具统计学意义(F=6.438,P=0.001)。重度OSAHS组高于对照组、轻中度OSAHS组、COPD组(P0.001,P=0.001,P=0.008),轻中度OSAHS组与对照组、COPD组比较,差异无显著性(P=0.65,P=0.254)。 2.2各组NF-KB蛋白的表达轻中度OSAHS组、重度OSAHS组、COPD组及对照组NF-κB P65蛋白表达分别为(0.90±0.09)VS(1.04±0.12)VS(1.02±0.17)VS(0.85±L0.12),总体差异有统计学意义(F=6.457,P=0.001)。轻中度OSAHS与对照组比较无显著性差异(P=0.395),重度OSAHS组及COPD组NF-κB P65表达均高于对照组,差异具统计学意义(P=0.001,P=0.002)。重度OSAHS组与COPD组相比较,无显著性差异(P=0.639)。 3. OSAHS患者NF-κB基因及蛋白的表达与疾病严重程度的相关性 3.1NF-κB基因表达与疾病严重程度的相关性 OSAHS组中(n=30),NF-κB P65mRNA与AHI呈正相关(r=0.493,P=0.006),与夜间最低血氧饱和度(LSaO2)呈负相关(r=-0.488,P=0.006),与平均血氧饱和度(MSaO2)、氧降指数(ODI)、嗜睡评分量表得分(ESS)均无相关性(r=-0.309,P=0.096；r=0.347,P=0.060；r=0.206,P=0.274)。 3.2NF-KB蛋白表达与疾病严重程度的相关性 OSAHS组中(n=24),NF-κB P65蛋白表达与AHI呈正相关(r=0.669,P0.001),与LSaO2, MSaO2、ODI、ESS均无相关性(r=-0.214,P=0.315；r=-0.286,P=0.176； r=0.379,P=0.067；r=-0.038,P=0.859)。 4.各组HIF-1基因及蛋白的表达 4.1各组HIF-1基因表达轻中度OSAHS组、重度OSAHS组、COPD组、对照组HIF-1αmRNA表达分别为(0.013±0.007)VS(0.033±0.038)VS(0.030±0.025)VS(0.008±0.006),差异具显著性(F=7.737,P0.001)。重度OSAHS组显著高于对照组及轻中度OSAHS组(P0.001,P=0.011),COPD组显著高于轻中度OSAHS组及对照组(P=0.012,P0.001),与重度OSAHS组比较,差异无显著性(P=0.633)。 4.2各组HIF-1蛋白表达轻中度OSAHS组、重度OSAHS组、COPD组及对照组HIF-1α蛋白表达分别为(0.87±0.17)VS(1.06±0.09)VS(1.09±0.19)VS(0.86±0.18),差异有统计学意义(F=7.058,P=0.001)。轻中度OSAHS组与对照组比较无显著性差异(P=0.825),重度OSAHS组HIF-1α表达均显著高于轻中度OSAHS组及对照组(P=0.007,P=0.002)。重度OSAHS组与COPD组比较,无显著性差异(P=0.727)。 5.OSAHS患者HIF-1基因及蛋白的表达与疾病严重程度的相关性 5.1HIF-1基因表达与疾病严重程度的相关性 OSAHS组中(n=30),HIF-1αmRNA表达与AHI呈正相关(r==0.508,P=0.004),与LSaO2、MSaO2呈负相关(r=-0.460,P=0.011；r=-0.405,P=0.026),与ODI、ESS均无相关性(r=0.344,P=0.062；r=0.249,P=0.184)。 5.2HIF-1蛋白表达与疾病严重程度的相关性 OSAHS组中(n=24),HIF-1α蛋白表达与AHI呈正相关(r=0.645,P=0.001),与ODI呈正相关(r=0.48,P=0.018),与LSaO2,MSaO2、ESS均无相关性(r=-0.306,P=0.146；r=-0.378,P=0.069；r=-0.122,P=0.571)。 6.OSAHS患者NF-KB基因、蛋白与HIF-1基因、蛋白的相关性研究 NF-κB P65mRNA与HIF-1αmRNA呈正相关(r=0.543,P=0.002),NF-κB P65、HIF-1α蛋白表达呈正相关(r=0.716,P0.001)。结论： 1. OSAHS患者同时激活了NF-KB依赖的炎症通路和HIF-1依赖的适应性通路。 2.随着OSAHS病情严重程度和缺氧程度的增加,NF-κB、HIF-1的基因和蛋白水平均增加,表明NF-κB、HIF-1的基因和蛋白表达与病情严重程度相关。 3. OSAHS发病与两转录因子均相关,且NF-κB与HIF-1存在相关性,可能通过某一转录因子调控另一转录因子来共同激活两条通路从而引起OSAHS的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R766

【相似文献】