GAP-43基因修饰干细胞对视网膜色素变性保护性研究

发布时间：2018-12-18 07:14

【摘要】：前言：视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种遗传性进行性视网膜退行性病变，在视网膜变性类疾病中，具有典型的代表性。RP国际发病率为1/3500～1/4000，好发于青壮年。目前认为该病的发生是由于视网膜色素上皮（retinalpigment epithelium，RPE）对光感受器细胞脱落的外节膜盘吞噬功能下降，致使其在视网膜外层堆积，光感受器细胞外节段结构紊乱，最终至光感受器细胞变性死亡。现阶段治疗RP已尝试多种方式，包括细胞移植治疗、基因治疗、细胞因子治疗、营养因子治疗]和高压氧治疗等。近年来，细胞移植疗法和基因疗法在治疗视网膜色素变性中取得了较大进展。基因疗法通过高表达神经营养因子基因或抗凋亡基因，发挥神经保护或抗凋亡作用。在细胞移植疗法中，移植细胞替代已经凋亡的细胞，也可通过分泌生长因子保护视网膜细胞。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在细胞移植疗法中具有广阔的应用前景，同时还是一种良好的载体，可介导外源基因稳定表达。因此将基因治疗及细胞治疗结合在一起，对BMSCs进行基因修饰后再移植到患者体内，既可以表达外源目的基因，也可同时发挥自身的营养保护及分化作用，理论上对治疗变性视网膜疾病具有重要探索意义。视网膜的神经上皮层是由6种神经元细胞组成。分别为：视杆细胞和视锥细胞，专司感光；双极细胞，约有10到数百个光感受器细胞通过双极细胞与一个神经节细胞相联系，起到联络作用；视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC），负责传导视觉信号；水平细胞和无长突细胞，负责视觉信息横向联系。故RP中视网膜细胞变性死亡，其本质为神经元结构及功能发生变化，最终变性凋亡。 GAP-43（growth-associated protein-43）是一种神经生长的相关蛋白，与神经发育和再生密切相关。我们之前利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehybridization，SSH)筛选出差异表达基因GAP-43，发现GAP-43基因在BMSCs向神经样细胞分化过程中起着重要作用。GAP-43基因导入原代BMSCs内后，体内外实验均证实了该基因对于BMSCs向视网膜神经细胞方向分化具有明显的促进作用。皇家外科学院大鼠（Royal College of Surgeons rat，RCS rat）是遗传性RP典型动物模型，本实验将经GAP-43基因修饰的BMSCs移植入RCS大鼠眼中，探讨在不同微环境下，GAP-43基因修饰的BMSCs分化情况；同时在细胞形态和功能角度上观察移植后对视网膜各层细胞产生的影响，特别是对视网膜光感受器细胞的保护作用，探讨视网膜色素变性新的治疗途径。目的：探讨GAP-43基因修饰的BMSCs对RCS大鼠视网膜保护作用。方法：利用单纯贴壁法在体外分离、培养SD大鼠BMSCs，经流式细胞术鉴定，得到状态稳定的BMSCs。构建慢病毒介导的GAP-43高表达载体（LV5-GAP），感染BMSCs后，得到GAP-43基因修饰的BMSCs（BMSCs-LV5-GAP-43）。将67只出生21天（P21）的雄性RCS大鼠随机分为三组：BMSCs+GAP-43组、BMSCs组和NC组。BMSCs+GAP-43组是将5×104/2ul GAP-43基因修饰的BMSCs的细胞悬液注射到RCS大鼠视网膜下；BMSCs组注射5×104/2ul BMSCs细胞悬液；NC组大鼠则仅将2ul PBS注射入视网膜下。应用免疫荧光，Western Blot免疫印迹法检测GAP-43、谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)和视紫红质（rhodopsin，Rho）表达水平。利用HE染色评估视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）厚度。应用原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick end labeling assay，TUNEL assay）评估视网膜神经元凋亡情况。应用WesternBlot免疫印迹法检测外源性凋亡通路介导因子Caspase-8和内源性凋亡通路介导因子Caspase-9的表达量，阐明GAP-43在视网膜色素变性中抗凋亡的途径及机制。结果：（1）体外分离培养的BMSCs可稳定传代，流式细胞仪检测细胞抗原：CD90和CD44表达阳性，CD11b和CD45表达阴性；GAP-43基因序列经酶切、转化、包装和转染得到慢病毒载体LV5-GAP；感染BMSCs后，Western Blot及细胞免疫荧光检测GAP-43在BMSCs-LV5-GAP-43中表达量升高（P＜0.05）；将细胞移植到视网膜下腔后，Western Blot显示， BMSCs+GAP-43组RCS大鼠视网膜下细胞移植后GAP-43表达显著增加（P＜0.05）；（2）Western Blot及免疫荧光检测显示，Rho在BMSCs+GAP-43组表达显著上调（P＜0.05），但BMSCs组与BMSCs+GAP-43组相比，GS在BMSCs组显著上调（P＜0.05）；组织学分析显示， BMSCs+GAP-43组ONL高度明显大于其他两组（P 0.05）；（3）细胞注射到视网膜下30天后，TUNEL检测显示， BMSCs+GAP-43组TUNEL阳性细胞数量与其他组相比明显减少（P0.05）；（4）Western Blot免疫印迹法显示，Caspase-8和Caspase-9在BMSCs+GAP-43组被显著下调（P0.05）。结论：（1）本研究成功分离、培养出大鼠BMSCs，，并构建了稳定携带GAP-43基因的慢病毒载体；感染BMSCs后能稳定、持久的表达GAP-43蛋白，移植BMSCs-LV5-GAP-43到RCS大鼠视网膜下腔，发现BMSCs在变性视网膜环境中逐渐消失，但是GAP-43表达量逐渐升高。（2）BMSCs-LV5-GAP-43移植到视网膜下腔，能减轻Müller细胞增殖作用，防止产生“胶质封闭”；BMSCs-LV5-GAP-43能保护光感受器细胞，维持视网膜光感受器细胞结构的完整性。（3）采用TUNEL方法检测到凋亡细胞主要集中在ONL，BMSCs-LV5-GAP-43移植后通过抗凋亡作用保护光感受器细胞，并且阻断由Caspase-9和Caspase-8介导的细胞内外源凋亡途径，抑制神经元凋亡，维持视网膜外核层完整性。（4）GAP-43基因修饰的BMSCs在RCS视网膜变性的2个月内，对RP视网膜有保护及抗凋亡作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1

【参考文献】