血红素加氧酶-1在过氧化氢介导的人晶状体上皮细胞氧化应激及细胞凋亡中的保护作用

发布时间：2019-02-09 21:00

【摘要】：目的：本实验旨在研究血红素加氧酶-1(HO-1)在过氧化氢(H202)介导的人晶状体上皮细胞(hLEC; SRA01/04细胞系)氧化应激损伤及细胞凋亡中的保护性作用。方法：hLEC分别在H202浓度梯度、HO-1诱导剂：钴原卟啉(CoPP)、锌原卟啉(ZnPP)浓度梯度的培养基内进行培养。同时,基因沉默技术成功降低HO-1在细胞内表达并用于本实验。细胞存活率使用CCK-8法进行观察。细胞内HO-1的表达水平利用蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。本实验中,人晶状体上皮细胞在400μM H2O2中预培养24h建立了氧化应激损伤模型，10μM CoPP和10μM ZnPP良好地诱导了HO-1并避免了严重的细胞毒性。免疫荧光双标法用于细胞鉴定及HO-1胞内表达的测定。DCFH-DA荧光探针用于检测细胞内的活性氧(ROS)水平。谷胱甘肽(GSH)和超氧化物岐化酶(SOD)水平检测使用微孔法商业检测试剂盒进行。Annexin V-FITC/PI染色用于量化不同处理组人晶状体上皮细胞细胞凋亡率,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族-3、-8(Caspase-3、-8)使用蛋白质印迹进行检测。结果：1、HO-1显著地降低ROS水平和增加GSH及SOD活性,从而明显地减轻了H202介导的hLEC氧化应激损伤。2、HO-1抑制H202介导的促进凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8,因此显著地降低了hLEC的凋亡率。3、RNA干扰验证了HO-1增强hLEC抵抗氧化应激损伤的作用。结论：本实验揭示了HO-1通过上调抗氧化酶(GSH、SOD)活性、降低活性氧(ROS)生成和抑制Caspase家族依赖的细胞凋亡从而保护hLEC免于氧化应激损伤及细胞凋亡。
[Abstract]:Aim: to investigate the protective effect of heme oxygenase-1 (HO-1) on oxidative stress and apoptosis of human lens epithelial cells (hLEC; SRA01/04) mediated by hydrogen peroxide (H202). Methods: hLEC was cultured in H202 concentration gradient and HO-1 inducer: cobalt protoporphyrin (CoPP), zinc protoporphyrin (ZnPP). At the same time, gene silencing technique successfully reduced the expression of HO-1 in cells and was used in this experiment. Cell survival rate was observed by CCK-8 method. The expression of HO-1 was detected by Western blot (Western blot) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this experiment, human lens epithelial cells were precultured in 400 渭 M H2O2 for 24 hours to establish oxidative stress injury model. 10 渭 M CoPP and 10 渭 M ZnPP induced HO-1 well and avoided serious cytotoxicity. Immunofluorescence double labeling method was used to identify cells and determine the intracellular expression of HO-1. DCFH-DA fluorescence probe was used to detect the level of reactive oxygen species (ROS) in cells. The levels of glutathione (GSH) and superoxide dismutase (SOD) were detected by micropore commercial assay kit. Annexin V-FITC/PI staining was used to quantify the apoptosis rate of human lens epithelial cells in different treatment groups. The aspartic protein hydrolase family-3-1-8 (Caspase-3,-8) containing cysteine was detected by Western blotting. Results: (1) HO-1 significantly decreased the level of ROS and increased the activities of GSH and SOD, which significantly alleviated the oxidative stress injury of hLEC mediated by H202. 2HHO-1 inhibited the apoptosis promoting proteins Caspase-3 and Caspase-8, mediated by H202. Therefore, the apoptosis rate of hLEC was significantly decreased, and the effect of HO-1 on the resistance of hLEC to oxidative stress injury was verified by HO-1 interference. Conclusion: this study revealed that HO-1 can protect hLEC from oxidative stress and apoptosis by up-regulating the activity of antioxidant enzymes (GSH,SOD), reducing the production of Ros and inhibiting the apoptosis of Caspase family dependent cells.
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776.1

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本文编号：2419387