慢病毒载体介导的HSP47 siRNA抑制PVR的研究

发布时间：2019-03-17 09:08

【摘要】：目的观察HSP47在PVR患者视网膜前增殖膜以及PVR动物模型视网膜组织中的表达,推测HSP47在PVR中可能的作用;通过观察慢病毒载体介导的HSP47si RNA对ARPE-19细胞上皮间质转化的影响,明确HSP47在PVR中的作用;观察LV-HSP47-si RNA对实验性PVR疾病进程的影响,验证LV-HSP47-si RNA对PVR的抑制作用。方法1.收集PVRC级~D级患者30例,玻璃体切割术中剥除视网膜前增殖膜,制作病理标本;收集同期作为角膜移植的供体眼12例,显微镜下剥除其内界膜作为对照。通过HE染色观察增殖膜的病理特征,Masson染色观察增殖膜中胶原蛋白的沉积,免疫组化染色观察增殖膜和内界膜中HSP47以及TGF-β2和I型胶原蛋白的表达。2.购买40只清洁级健康成年青紫蓝兔,参照文献方法建立PVR动物模型,均以右眼作为实验眼,左眼作为对照眼,在造模的不同时间点摘除实验眼,制作病理标本。通过HE染色观察PVR模型中视网膜组织的病理特点,Masson染色观察视网膜组织中胶原蛋白的沉积,免疫组化染色观察视网膜组织中HSP47以及TGF-β2和I型胶原蛋白的表达。3.体外实验:体外培养的处于对数生长期的ARPE-19细胞,将细胞随机分为5组:⑴未处理组;⑵TGF-β2处理组;⑶TGF-β2处理+LV-HSP47-si RNA转染组;⑷TGF-β2处理+慢病毒空载体转染组;⑸TGF-β2处理+PBS组。其中⑵~⑸组细胞用TGF-β2预处理12h,促使细胞发生上皮间质转化,再分别给予⑶、⑷、⑸组细胞10μl LV-HSP47-si RNA、慢病毒空载体和PBS共孵育48h,通过荧光显微镜观察细胞转染效率,CCK8实验检测细胞活力,RT-PCR检测基因沉默效率,通过荧光定量PCR和western blot检测各组细胞HSP47、α-SMA、FN和I型胶原蛋白的表达。4.体内实验:购买36只健康成年青紫蓝兔,随机分为3组,每组12只,分别为:⑴LV-HSP47-si RNA转染组;⑵慢病毒空载体转染组;⑶PBS对照组;均以右眼为实验眼,建立PVR模型。于造模7d时分别给予玻璃体腔内注射LV-HSP47-si RNA、慢病毒空载体和PBS,剂量均为10μl,观察造模后不同时间点实验眼的临床特征,通过HE染色观察造模7d、14d和28d时实验眼的组织病理学特征,通过荧光定量PCR和western blot测定造模28d各组实验动物的视网膜组织中HSP47、α-SMA、FN和I型胶原蛋白的表达。结果1.PVR患者增殖膜HE染色可见:增殖膜组织中存在类圆形上皮样细胞及长梭形成纤维样细胞,附着在胶原丰富的细胞外基质中,散在色素颗粒;Masson染色可见增殖膜内胶原蛋白大量聚集;免疫组化染色见增殖膜中HSP47以及TGF-β2和I型胶原蛋白的表达呈强阳性,且表达部位均为细胞浆及细胞外基质。2.青紫蓝兔PVR动物模型在造模后逐渐出现玻璃体混浊、较粗的纤维增殖条索和局限性牵拉性视网膜脱离以及漏斗状视网膜脱离,造模成功率可达100%。造模后,青紫蓝兔PVR模型视网膜组织的病理学特征为:HE染色可见视网膜表面有炎细胞聚集,成纤维细胞增生,逐渐出现视网膜表面增殖条索,视网膜水肿、皱褶及牵拉性视网膜脱离,细胞层次结构紊乱不清,纤维结缔组织增多;实验性PVR各期均可见视网膜表面存在胶原蛋白增多;免疫组化染色可见HSP47以及TGF-β2和I型胶原蛋白的表达随病程延续逐渐增强;正常对照组兔眼玻璃体呈透明胶冻样,视网膜各层组织结构完整,免疫组化染色可见TGF-β2、HSP47和I型胶原蛋白均存在弱阳性基础表达。3.体外实验:⑴5ng/ml TGF-β2处理体外培养的ARPE-19细胞后,细胞间质标记物α-SMA、FN和I型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达水平显著上调,与未处理组比较,差异有统计学意义(P均0.05)。⑵细胞转染LV-HSP47-si RNA实验结果示:培养基中聚凝胺(polybrene)的终浓度为5μg/ml,感染复数(MOI)为10时,转染效率最高(75%);转染后LV-HSP47-si RNA组和慢病毒空载体组的细胞活力与PBS组比较,差异无统计学意义(P0.05),说明转染对细胞没有明显的毒性;细胞转染LV-HSP47-si RNA后,通过RT-PCR检测HSP47 m RNA的表达显著下调,与慢病毒空载体组和PBS组比较,差异有统计学意义(P0.05),敲除效率可以达到75%以上。⑶通过荧光定量PCR和western blot测定HSP47、α-SMA、FN和I型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达水平,结果显示:细胞转染LV-HSP47-si RNA后,对于TGF-β2诱导的HSP47、α-SMA、FN和I型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达上调,均有显著的抑制作用,与慢病毒空载体组和PBS组比较,差异有统计学意义(P均0.05)。4.体内实验:⑴建模后不同时间点的眼底彩照和B超示:慢病毒空载体组和PBS组病程和病情进展相似,逐渐出现玻璃体混浊和粗大的增殖条索、局限性牵拉性视网膜脱离和漏斗状视网膜脱离,LV-HSP47-si RNA组,出现玻璃体混浊及增殖条索后,继续发生明显进展的数目显著减少;⑵Fastenberg分级结果显示:造模14d和28d,合并有视网膜脱离的比率LV-HSP47-si RNA组均少于慢病毒空载体组和PBS组,差异有统计学意义(χ2=7.598,6.143;P=0.016,0.027)。⑶建模28d,荧光定量PCR和western blot测定各组实验动物的视网膜组织中HSP47、α-SMA、FN、I型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达水平,结果显示:玻璃体腔注射转染LV-HSP47-si RNA后,实验眼视网膜组织HSP47、α-SMA、FN和I型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达水平均显著下调,与慢病毒空载体组和PBS组比较,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论1.HSP47在PVR增殖膜和PVR动物模型的视网膜组织中表达增强,且与I型胶原蛋白的表达部位一致。2.HSP47可能通过促进胶原蛋白合成而参与PVR的病理性瘢痕形成过程。3.通过玻璃体腔注射LV-HSP47-si RNA,转染PVR实验动物,可以显著抑制PVR的病程,降低牵拉性视网膜脱离的发生率。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1

【共引文献】