腺病毒介导p21抑制视网膜新生血管生成的实验研究

发布时间：2019-03-30 16:29

【摘要】：目的：视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病,而新生血管的生成依赖于血管内皮细胞的不断分裂增殖。p21是细胞周期中重要的负性调控因子,主要参与细胞周期中G1/S期调控点的调控,可使细胞阻滞于G1期,抑制细胞增殖。本研究通过建立氧诱导RNV小鼠模型并检测p21、CDK2及CyclinE mRNA和蛋白在视网膜组织中的表达,探讨p21在RNV生成过程中的作用及机制；进而应用腺病毒载体将p21基因转染至猴视网膜微血管内皮细胞及RNV模型小鼠视网膜组织,观察其对血管内皮细胞增殖、迁移及RNV的抑制作用及机制。 方法：(1)选取7日龄C57BL/6J小鼠,共96只,随机分为实验组与对照组,每组48只。实验组小鼠按照Smith法建立氧诱导RNV模型,分别于P12、P17、P22时行荧光视网膜铺片及组织病理学检查评估两组小鼠RNV的发生情况,行逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot. WB)检测p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在两组小鼠视网膜组织中的表达。(2)体外培养猴微血管内皮细胞(RF/6A),取第3～5代处于对数生长期的RF/6A接种到6孔板内,细胞同步化后,分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)组、腺病毒介导p21基因(adenovirus mediated delivery of p21,Ad-p21)组及腺病毒介导空基因(adenovirus mediated delivery of non-target control. Ad-NC)组,分别应用PBS、Ad-p21及Ad-NC转染RF/6A,培养48h,行流式细胞仪、Transwell检查及成管实验,行RT-PCR及WB检测p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在RF/6A中的表达。(3)选取7日龄C57BL/6J小鼠,共80只,随机分为对照组、PBS组、Ad-p21组及Ad-NC组,每组20只。其中PBS组、Ad-p21组及Ad-NC组小鼠按照Smith法建立氧诱导RNV模型。P11时,非常组不做任何处理,PBS组、Ad-p21组及Ad-NC组玻璃体腔分别注入PBS、Ad-p21及Ad-NC1u1。P17及P22时行荧光视网膜铺片及组织病理学检查评估RNV的发生情况,P17时行RT-PCR及WB检测p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在视网膜组织中的表达。 结果：(1)与对照组比较,P17时实验组小鼠荧光视网膜铺片显示大面积无灌注区及荧光素渗漏,视网膜切片可见大量突破内界膜的血管内皮细胞核。实验组小鼠视网膜组织中p21mRNA和蛋白表达较对照组明显下降,差异有统计学意义；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表达较对照组则明显升高,差异有统计学意义。(2)流示细胞仪结果显示Ad-p21组RF/6A细胞出现G0/G1期阻滞,G0/G1期细胞较PBS组及Ad-NC组比例明显增多,差异有统计学意义。Transwell结果显示较PBS组和Ad-NC组,Ad-p21组RF/6A细胞穿膜能力明显减弱,穿膜细胞数较少,差异有统计学意义。体外成管实验显示较PBS组和Ad-NC组,Ad-p21转染组内皮细胞管数较少,差异有统计学意义。Ad-p21组细胞中p21mRNA和蛋白表达较PBS组和Ad-NC组明显升高,差异有统计学意义；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表达较PBS组和Ad-NC组则明显降低,差异有统计学意义。(3)Ad-p21组视网膜无灌注区及新生血管较PBS组和Ad-NC组明显减少。Ad-p21组视网膜组织p21mRNA及蛋白表达较其余三组显著增高,差异有统计学意义,而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表达较其余三组显著降低,差异有统计学意义。 结论：(1)p21表达降低可能是视网膜新生血管生成的发病机制之一。(2)Ad介导p21通过上调p21及下调CDK2、CyclinE的表达,发挥对细胞周期的调控作用,使RF/6A细胞停滞于G0/G1期并抑制其增生和迁移。(3)Ad介导p21可通过上调p21及下调CDK2、CyclinE的表达,抑制视网膜微血管内皮细胞的分裂、增生,从而发挥其抑制视网膜新生血管生成的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R774.1

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本文编号：2450270