Wnt信号通路抑制蛋白Chibby在喉癌发生中的作用

发布时间：2019-11-08 12:50

【摘要】：目的：国内外大量研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤的发生、发展存在密切的关系。Chibby为近年来新发现的该信号通路拮抗剂，通过对β-catenin的抑制，拮抗异常Wnt信号，可能是潜在的肿瘤抑制因子。已有研究表明Chibby与多种肿瘤的发生存在一定的关系，但尚无Chibby与喉癌关系的研究报道。本研究旨在从表达及功能层面系统阐述Chibby与喉癌的关系，为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在喉癌发病中的作用机制，寻找新的作用靶标，为喉癌的基因治疗奠定基础。方法： 1、分别采用Real-time PCR方法及免疫组织化学方法（SP法）检测喉癌组织与相应癌旁正常喉粘膜中Chibby mRNA及蛋白的表达变化。应用统计软件SPSS17.0统计分析肿瘤组织中Chibby mRNA及蛋白的表达差异与喉癌患者不同年龄、性别、临床分期及肿瘤分化程度间的关系。 2、通过GeneBank检索人类Chibby mRNA编码序列，应用引物设计软件Primer premier5设计引物获取目的片段，经XbaⅠ/MIuⅠ双酶切后构建重组质粒plv-cs2.0-Cby。利用脂质体（TurboFect）法进行慢病毒包装获取病毒上清。采用相同滴度的病毒上清感染喉癌细胞系Hep-2，经Puro筛选获得稳定表达Chibby的Hep-2细胞系，分别采用Real time PCR方法及Western blot方法检测稳转细胞系中Chibby的过表达效率。 3、分别采用MTT法检测细胞增殖能力；平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；流式细胞术检测细胞周期分布；Tunel染色检测细胞凋亡情况。结果： 1、与正常喉粘膜相比较，喉癌组织中Chibby mRNA及蛋白表达的降低率分别为56.67%（17/30）及80.00%（24/30），差异有统计学意义（p＜0.05）。喉癌组织中Chibby mRNA及蛋白的表达差异与患者的性别、年龄、临床分期及肿瘤分化程度间无明显关系（p＞0.05）。 2、目的基因PCR扩增得到421bp大小的目的片段，重组质粒经XbaⅠ/MIuⅠ双酶切后得到8750bp及414bp大小的基因片段，经XbaⅠ/KpnⅠ双酶切后得到6886bp、1384bp及894bp大小的基因片段，均与理论大小相符，序列测定与Genebank公布一致。经Real time PCR方法检测发现Chibby mRNA过表达了276.92倍（p＜0.01），经Western blot方法检测发现过表达了外源Chibby蛋白，未见内源Chibby蛋白条带，差异有统计学意义（p＜0.01）。 3、与control组及plv-cs2.0组细胞相比较，plv-cs2.0-Cby组细胞增值能力减弱，且随着时间延长，减弱越明显（P＜0.05）。plv-cs2.0-Cby组细胞的克隆形成数及克隆面积明显低于control组与plv-cs2.0组（P＜0.01）。流式细胞术分析发现，plv-cs2.0-Cby组细胞滞留在G1期；而S细胞明显减少（P＜0.05）。TUNEL染色发现，相对于control组及plv-cs2.0组， plv-cs2.0-Cby组的凋亡比例明显增加（P＜0.01）。而control组与plv-cs2.0组细胞间的增值能力、克隆形成能力、细胞周期分布及凋亡比例无差异（P＞0.05）。结论： 1、与正常喉粘膜相比较，喉癌组织中Chibby mRNA及蛋白的表达水平均降低，未发现喉癌组织中Chibby mRNA及蛋白的表达差异与患者的性别、年龄、临床分期及肿瘤分化程度间存在相关关系。 2、酶切鉴定及序列测定结果显示，成功构建了plv-cs2.0-Cby慢病毒真核过表达载体，经慢病毒包装及感染喉癌细胞系Hep-2后，在Hep-2中有效的过表达了外源Chibby，为功能实验奠定了基础。 3、过表达Chibby后，有效的抑制了喉癌细胞系Hep-2的增值能力及克隆形成能力，将Hep-2细胞滞留在G1期，促使了Hep-2细胞的凋亡。因此，过表达Chibby有望成为喉癌靶向基因治疗的有效手段。
【图文】：

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只有这两种机制共同作用才能有效的抑制Wnt信号通路的活性【12】（见图1）。另外，还需保证Chibby的空间构象稳定，，若为单体，虽具有抑制β-catenin的能力，并保持了自身从胞质向胞核内转移的能力，但其转运效率大大降低【11】。另外，甲状腺癌-1（Thyroid cancer-1，TC-1）通过与Chibby结合从β-catenin/Chibby复合体中解离出Chibby，增强β-catenin的活性【13】。图1：Chibby抑制β-catenin作用机制的示意图（图片来源于【7】）Chibby作为潜在的肿瘤抑制因子

实验者,喉粘膜,病理科,对象

该研究的研究对象均符合入选标准，由实验者 1 人在临床收集，并由实验者 1 人收集病人的相关临床资料，严格按照病理回报结果登记填写，对研究对象的病理标本进行编码至所有结果出来后破码，各个实验均由实验者本人在同一实验室、同一实验仪器及同一批号试剂的条件下完成，实验过程中合理设立平行对照以及阳性或阴性对照，病理诊断及结果判定以两名训练有素的病理科医师观察结果为准。3 结果3.1Real-time PCR 方法检测 Chibby mRNA 的表达结果3.1.1 荧光定量 PCR 仪检测结果图及意义提取同一患者正常喉粘膜及喉癌组织中的总 RNA，逆转录为 cDNA，以 18sRNA 作为内参，通过 Real time PCR 法检测 Chibby mRNA 的表达水平。图 2 显示 Real-time PCR 检测时的扩增曲线和溶解曲线。扩增曲线图显示各样品的反应均已达到平台期，溶解曲线显示 Chibby 与 18sRNA 为单一的峰。提示引物设计合理，RNA 样品完整、无降解，PCR 扩增产物特异性高，实验数据可信。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.65

【参考文献】