基于二代测序技术的遗传性耳聋分子病因学研究

发布时间：2020-04-07 05:55

【摘要】：目的:运用靶向序列捕获测序技术对98个遗传性耳聋家系进行分子病因学的分析,以期能够明确其致病原因,探究更多已知基因的致聋机制并发现新的致病位点,为耳聋的预防、诊断和治疗奠定分子病因学基础。方法:选取课题组遗传性耳聋基因库中98例没有检测到GJB2、SLC26A4常见位点及线粒体DNA1555和1494变异位点的耳聋家系,分析先证者及家庭成员的病史、听力学、影像学及体格检查资料。选择血液基因组试剂盒法提取基因组DNA,使用个性化定制的耳聋基因Panel对目前所报道的己知耳聋基因(包括245个核基因和线粒体基因)进行靶向捕获并富集,然后再使用Illumina测序平台进行二代测序。通过生物信息学分析筛选出可能致病的变异,最后对所有发现的可能致病变异的基因片段上下游设计引物,进行PCR扩增后用于Sanger测序,将所得结果与标准序列比对,从而明确责任基因及变异。同期收集207例听力正常人群的临床资料及血样作为对照组。结果:1、临床病史资料分析结果:98例先证者中,综合征型耳聋患者1例,非综合征耳聋患者97例。常染色体显性遗传家系8例,常染色体隐性遗传家系90例。听力学检查结果分析:中度感音神经性耳聋4例,中重度感音神经性耳聋6例,重度感音神经性耳聋8例,极重度感音神经性耳聋80例,其中语前聋90例,语后聋8例。2、98例样本共发现181个基因的1127种非同义或剪接位点变异,其中非同义变异1011种,无义变异30种,移码插入缺失变异86种。其中129个基因是目前已知与耳聋相关的,总共有937种变异;而另52个基因是在其他物种有报道与耳聋相关但是在耳聋人群中没有报道或在其他疾病中报道过与线粒体功能相关但在耳聋人群中没有发现的基因,这52个基因共检测到190种变异。3、98例样本中,在32例常染色体隐性遗传性耳聋先证者鉴定出35种纯合变异,其中有7个变异已经报道过,其中:CDH23:c.C719T(p.Pro240Leu);LHFPL5:c.C494T(p.Thr165Met);MYO15A:c.6340GA(p.Val2114Met);OTOF:c.2977_2978del;SLC26A4:c.T716A(p.Val239Asp)以及TMPRSS3:c.G727A(p.Gly243Arg)均有研究证据支持其属于致病变异。PCDH15:c.1195AC(p.Ser399Arg)在其他研究者的结果中属于致病性不确切,需要更多的研究数据明确其致病性。在29个新发现的变异中,15个是无义变异或移码插入缺失变异,14个为错义变异,上述变异通过同源序列比对发现它们均处于蛋白质功能保守区;通过Mutation Taster,Polyphen2_HVAR和SIFT预测程序中至少一个预测结果为致病,且在207例正常听力对照组中并未发现上述变异,提示它们可能改变了编码蛋白的结构或功能,从而引起耳聋的可能。4、98例样本中,在8个显性遗传性耳聋先证者中鉴定出了3个致病变异,其中SOX10:c.342GA(p.Trp114X)为未报道过的新的致病变异,其导致Waardenburg综合征2E型,且207个正常听力对照组中没有发现该变异。其余两个变异GJB2:c.551GA(p.Arg184Gln)、WFS1:c.2051CT(p.Ala684Val)已有报道,表明其分别与常染色体显性遗传性耳聋3A型、常染色体显性遗传性耳聋6/14/38型相关。结论:1、本研究在98例样本中,为32例常染色体隐性遗传性耳聋先证者及8例显性遗传性耳聋家系明确了致病原因。该结果将为这些家系的遗传性耳聋提供明确的分子病因学诊断及有效的遗传咨询,为其耳聋预防、诊断及治疗提供了有力的理论指导。2、本研究在已知的耳聋基因中发现29个新变异,采用生物信息学方法预测了其致病的可能性。这些研究结果为后续的功能研究提供了理论基础,同时不仅为更多的耳聋家庭明确分子病因学诊断,也为耳聋基因库增添了新的成员3、本次研究发现的190种变异需要更多的研究(包括病例筛查及功能验证等)确定其在耳聋人群中的致病性。4、本次研究结果提示,在常染色体隐性遗传性耳聋患者中,除GJB2、SLC26A4及线粒体DNA m.1555AG和m.1494CT变异为常见的致聋基因,MYO15A基因、CDH23基因、OTOF基因、FGF3基因也可作为常规致聋基因的候选基因,为耳聋的临床诊断提供了更多的选择,也为将来设计中国西北地区新生儿耳聋基因筛查试剂盒提供更多的理论支持。
【图文】：

文库构建,实验流程

2.4.2 测定 DNA 得率和纯度将所获的基因组 DNA 通过分光光度计测定提取量，空白对照用上述步骤所使用的洗脱液做。DNA 纯度测定采用 260 nm 和 280 nm 测定光吸值做对比的方法，参考当 A260/A280 比值在 1.7-1.9，，表明该样本的 DNA 纯度在 85%-90%。记录每个样品的纯度及浓度，样本量多时可进行分装标记，避免反复多次冻融。2.4.3 耳聋基因二代测序流程1.目标基因捕获：本研究采用 Agilent 液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域 DNA 进行高效富集。采用 Agilent SureSelect HumanAll ExonV5 试剂盒实验流程操作进行建库和捕获实验。用 Covaris 破碎仪将提前提取的基因组 DNA 随机打断成长度为 180-280bp 的片段，通过在末端修复和加 A 尾操作后在片段两端分别连接上接头以制备 DNA 文库。将带有特异 index 的文库 pooling 后与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将 246 个基因的外显子捕获下来，文库质检是经 PCR 线性扩增进行的，合格的方可用于进行下一步测序。2.测序策略：Illumina HiSeq 2500 PE125 测序。

柱状图,频率分布,柱状图,遗传性耳聋

兰州大学硕士学位论文基于二代测序技术的遗传性耳聋分子病因学研究other 693.2.2 变异频率统计经过滤掉除 exonic 区域非同义变异（或者移码变异）和 splicing 区域以外的变异位点后，SNV 有 4307 个，Indel 有 173 个。其中 SNV 及 Indel 变异频率分别如图 2,图 3 所示。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R764.43

【相似文献】