胃蛋白酶对喉粘膜上皮的损伤及机制研究

发布时间：2020-04-07 18:16

【摘要】：目的和意义胃内容物反流至咽喉,引起的咽喉反流性疾病(Larynghopharyngeal reflux disease,LPRD)受到耳鼻咽喉科学界广泛关注,由于咽喉反流的致病机制不清,至今缺少诊断LPRD特异性方法和的诊断金标准,治疗上也存在接近50%的患者用质子泵抑制剂抑酸治疗效果欠佳。文献证实胃蛋白酶(pepsin)是LPRD的主要损伤因子,但是,pepsin是如何损伤咽喉粘膜上皮的机制不清楚,研究报道较少。本研究通过研究建立人喉粘膜原代细胞株,研究pepsin损伤喉粘膜上皮的机制,为咽喉反流性疾病的致病机制提供新理论,并探索新的治疗策略。方法手术中取声门下、室带、会厌、环后等不同部位正常人喉组织,通过两步酶加组织研磨法进行喉上皮原代细胞培养。构建pLVTHM-BMI-1质粒,慢病毒感染喉上皮原代细胞诱导其永生化,Westem blot检测BMI-1、hTERT、p53及pRB通路各蛋白的表达水平,探究BMI-1感染喉上皮细胞后引起的分子生物学变化。并通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色检测、EdU细胞增殖实验、流式细胞周期实验,验证永生化细胞株功能特性。在pH=7环境下,用不同浓度pepsin(Omg/ml、0.1mg/ml和1mg/ml)刺激喉上皮永生化细胞,通过氧化应激检测、线粒体膜电位检测及彗星实验检测ROS生成,线粒体损伤及细胞核DNA损伤情况。通过荧光定量PCR检测炎性细胞因子(IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL8、IL10、IL18)表达情况。加入NADPH氧化抑制剂(DPI和Apocynin)或ROS清除剂(Tempol)预处理后,观察其对pepsin线粒体损伤、炎性细胞因子表达及细胞核DNA损伤的影响。进一步通过Western blotting检测DNA损伤标物p-H2AX以及ROS通路蛋白表达,从而探索Pepsin通过ROS介导喉上皮DNA损伤的可能机制。选用标本库中有详尽的多通道腔内阻抗PH检测数据,与咽喉反流相关的声带息肉组织标本(32例)及健康志愿者喉粘膜标本(16例),进行p-H2AX和8-OHdG免疫组化染色,探究声带息肉组织中pepsin与DNA损伤的关系。结果1.喉原代细胞培养及永生化细胞株构建(1)成功培养出喉上皮原代细胞通过酶消化法加组织研磨成功培养出喉腔不同区域原代细胞(包括环后、会厌、声门下、室带),光镜下可见细胞形态为类圆形,光镜下折光性好,呈铺路石样贴壁生长,存在接触抑制现象,能成功传代,CK表达阳性,证明该细胞来自上皮。(2)建立稳定表达BMI-1的声门下及室带细胞本课题组利用BMI-1介导建立并验证了两株永生化喉上皮细胞(声门下BMI-1细胞与室带BMI-1细胞),通过qPCR及Wb提示BMI-1的过表达,端粒酶检测提示,hTERT蛋白水平升高,端粒酶活性增加,western blotting提示过表达BMI-1后p16、p21的表达逐渐降低,同时磷酸化RB的表达增高。(3)声门下BMI-1与室带BMI-1细胞功能学研究通过β-半乳糖苷酶衰老分析实验、Edu增殖实验、细胞周期流式检测实验提示喉上皮细胞转染BMI-1后,衰老细胞显著减少,细胞活性增强,处于S期细胞增多,细胞增殖加快。裸鼠成瘤实验提示室带上皮细胞、声门下细胞,声门下BMI-1与室带BMI-1细胞未见肿物形成,Hep-2细胞为阳性对照可见肿物形成。2.Pepsin对喉上皮细胞的损伤作用通过用不同浓度的pepsin(Omg/ml、0.lmg/ml、lmg/ml)在pH7环境下刺激声门下BMI-1与室带BMI-1细胞,结果提示随着pepsin浓度的增高,ROS生成升高,线粒体膜电位增加,炎性细胞因子(IL1α、IL1[β、IL6、IL8)分泌量上调,并且DNA损伤加重。3.Pepsin通过ROS介导喉上皮损伤机制研究加入NADPH氧化抑制剂(Apocynin和DPI)和ROS清除剂(Tempol)后ROS生成量、线粒体损伤、炎性细胞因子分泌及DNA损伤显著减少。pepsin刺激后p-ERK、p-JNK、c-Jun蛋白表达上调,加入apocynin预处理表达显著下调。4.声带息肉中Pepsin与氧化应激DNA损伤关系声带息肉组组织中8-OHdG、P-H2AX免疫组化染色强度均高于正常人群组(P0.01)。声带息肉中Pepsin表达与8-OHdG、P-H2AX表达呈正相关(r=0.348,P=0.008和r=0.254,P=0.041)。P-H2AX评分与8-OHdG评分基本相似,与咽喉酸反流立位和总数的四项参数(包括酸反流次数、酸反流时间、酸反流时间百分比、平均酸清除时间)之间有显著正相关(P0.05);与食道酸反流参数中立位及总pH4时间、最长反流时间之间有显著正相关(P0.05)。结论1.成功培养出环后、会厌、声门下、室带原代细胞,建立稳定表达BMI-1的声门下及室带永生化细胞株。2.pepsin刺激促进喉上皮细胞DNA及线粒体损伤、ROS生成增加、炎症因子分泌增加。3.pepsin通过ROS/MAPK/炎症信号通路引起喉上皮细胞DNA损伤。4.声带息肉中pepsin与DNA氧化损伤密切相关。
【图文】：

形态图,上皮,生长过程,形态

现重叠生长，此时成纤维细胞占培养物的＜５％，在光学显微镜下观察到成纤维逡逑细胞样的形态，每视野不到５个细胞，其中约有１５０个细胞。用胰酶消化传逡逑代，ＤＭＥＭ高糖完全培养基终止消化，细胞能成功传代（图１－１）。逡逑种板后逦—逦ＤＡＹ２邋逦逡逑■ｋｖ．＃ｔ邋－ｆ逦＾邋＾邋ａ邋■邋＊＊逦＾逡逑＼Ｚ．－邋￣＊邋＾逦＞？．邋－邋：邋－逦■－．？？Ｔ－－邋■逦；逦ｉｍＴｘ邋｜｜ｌ＞逦＾逦—邋＿逡逑－逦，＆■逦ｖ－ｔ邋＾邋ｉ１逡逑Ｓ邋？：．－ｆ邋＿邋ｆｒ说泛％邋—邋厶逡逑ＤＡＹ６逦ＤＡＹ１４逡逑图１－１．喉上皮原代细胞的生长过程及形态（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｌａｒｙｎｇｅａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋（２００Ｘ）逡逑２２逡逑

喉腔,上皮,荧光染色,上皮细胞

现重叠生长，此时成纤维细胞占培养物的＜５％，在光学显微镜下观察到成纤维逡逑细胞样的形态，每视野不到５个细胞，，其中约有１５０个细胞。用胰酶消化传逡逑代，ＤＭＥＭ高糖完全培养基终止消化，细胞能成功传代（图１－１）。逡逑种板后逦—逦ＤＡＹ２邋逦逡逑■ｋｖ．＃ｔ邋－ｆ逦＾邋＾邋ａ邋■邋＊＊逦＾逡逑＼Ｚ．－邋￣＊邋＾逦＞？．邋－邋：邋－逦■－．？？Ｔ－－邋■逦；逦ｉｍＴｘ邋｜｜ｌ＞逦＾逦—邋＿逡逑－逦，＆■逦ｖ－ｔ邋＾邋ｉ１逡逑Ｓ邋？：．－ｆ邋＿邋ｆｒ说泛％邋—邋厶逡逑ＤＡＹ６逦ＤＡＹ１４逡逑图１－１．喉上皮原代细胞的生长过程及形态（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｌａｒｙｎｇｅａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋（２００Ｘ）逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R766.5

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