HMGB1介导的自噬-溶酶体通路对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症和凋亡的影响

发布时间：2020-04-09 00:40

【摘要】：目的:本文旨在讨论高迁移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)介导的自噬-溶酶体通路对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞(Acute retinal pegment epitheliitis-19,ARPE-19)炎症和凋亡的作用及其机制。方法:将ARPE-19细胞分为正常组和高糖组,在培养液中加入自噬抑制剂3-MA或转染HMGB1的siRNA,并设立相应的对照组。采用电子显微镜检查自噬体;利用免疫荧光技术检测自噬相关蛋白的表达;Western blotting检测自噬相关蛋白及HMGB1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡;DCFH-DA法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;通过JC-1检测线粒体膜电位;ELISA检测细胞炎症因子及VEGF的表达。结果:与正常组比较,高糖条件下细胞内的自噬体数量明显增加,自噬相关蛋白的表达明显增加,自噬产生的降解底物积累明显增加,溶酶体膜通透性增加,溶酶体酶活性下降,HMGB1表达增加。与高糖对照组相比,在高糖组加入自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡明显进一步增加,炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF的释放进一步增多。利用siRNA干扰HMGB1的表达后,与高糖组相比,转染HMGB1siRNA的细胞HMGB1蛋白表达水平降低,自噬产生的降解底物和溶酶体膜通透性降低,溶酶体酶活性增加,线粒体膜电位升高,细胞内ROS产生以及细胞色素C的释放明显减少,细胞凋亡明显受到抑制,炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF的表达明显降低。结论:1、高糖可以激活自噬,但由于溶酶体通透性增加,溶酶体功能受损,导致自噬-溶酶体降解功能受损。2、高糖环境下,抑制细胞自噬活性会促进细胞凋亡,导致炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8以及VEGF释放进一步增加。3、高糖可诱导细胞HMGB1表达增加,在抑制HMGB1表达以后,其可能通过降低溶酶体膜通透性,从而恢复细胞自噬降解功能,使线粒体膜电位升高,减少ROS的产生,并减少细胞色素C的释放,从而抑制细胞凋亡,并减少炎症因子及VEGF释放。
【图文】：

图 1 高糖处理后各组 ARPE-19 细胞自噬相关蛋白及自噬体（红色圈表示自噬溶酶体，黑色圈表示自噬小泡）的表达Figure 1 Analysis of protein expressions of Beclin 1,ATG5 and LC3 and autophagosome (redcircles mean autophagolysosome and black circles meanautophagic vacuole. ) in ARPE-19 cellsfrom different groups after HG treatment. Scale bars: 2 μm (left), 1 μm (right). (*: P<0.05; **:P<0.01; ***: P<0.001)2.2 高糖可抑制 ARPE-19 细胞自噬降解能力为了研究高糖条件下 ARPE-19 细胞自噬的降解能力，我们将细胞置于高葡萄糖培养基中培养，，利用 Western blotting 分别在 0 小时，12 小时，24 小时，48 小时检测自噬选择性底物 P62/SQSTM1（此后，简称 P62）的表达，结果如图 2a 所示，随着在高糖条件下培养时间的延长，P62 的积累逐渐增加（P <0.05），并在 24 小时达到最高峰（故此后我们把研究时间点放在 24 小时）。此外，为了进一步验证蛋白水平检测的结果，我们利用免疫荧光的方法检测了在低葡萄糖和高葡萄糖培

图 2 高糖对自噬降解功能的影响Figure 2 Effects of HG on the degradative function of autophagy in ARPE-19 cells. Scale bars:25 μm (***: P<0.001)2.3 高糖环境可导致 ARPE-19 细胞溶酶体功能障碍，从而抑制其自噬降解能力为了研究高糖条件下 ARPE-19 细胞溶酶体功能状况，我们分别在低葡萄糖和高葡萄糖培养基中培养 24 小时，然后对溶酶体酶 B（cathepsin B, CB）和溶酶体酶 L（cathepsin L, CL）活性进行检测，结果显示在高糖条件下培养的 ARPE-19 细胞内的 CB（图 3a）和 CL（图 3b）活性较低糖组均明显降低（P <0.05）。同时，为了检测 LMP 是否增强，我们利用免疫荧光对 CB 和溶酶体特异性蛋白 LAMP1进行共定位染色，结果如图 3c 所示，较低糖组相比，高糖条件下培养的 ARPE-19细胞中，大量 CB 没有共定位于溶酶体当中，而是散布在细胞质当中（P <0.05）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1

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本文编号：2620047