MicroRNA-203a-3p通过靶向VEGFC影响鼻咽癌的增殖、迁移和侵袭

发布时间：2020-04-20 09:59

【摘要】：miR-203a-3p常表达于多种恶性肿瘤,其低表达与肿瘤生物学特性密切相关。本研究的目的是探讨miR-203a-3p及其直接靶基因VEGFC对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭、血管拟态形成、上皮间质转化等恶性生物学行为的影响及相关作用机制,进而为鼻咽癌的分子诊断和治疗提供新的靶点。本研究主要分为四个部分:第一部分:运用RT-PCR检测鼻咽癌细胞系5-8F和C666-1中miR-203a-3p的表达水平,运用RT-PCR和免疫荧光方法检测15例鼻咽癌病理组织及8例癌旁组织和两种鼻咽癌细胞系5-8F和C666-1中VEGFC的表达水平,结果发现miR-203a-3p在鼻咽癌细胞中表达量明显降低,而VEGFC在鼻咽癌组织和细胞中表达量明显升高。第二部分:探讨miR-203a-3p对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响。采用Lipofectamine 2000脂质体转染技术,将外源合成的miR-203a-3p mimics和miR-203a-3p inhibit以及各自的阴性对照物转染至鼻咽癌细胞系5-8F、C666-1中,通过上调或下调miR-203a-3p表达,研究miR-203a-3p对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期、血管拟态和上皮间质转化现象的影响,同时建造裸鼠皮下荷瘤模型,研究miR-203a-3p对鼻咽癌体内生长的影响。采用平板克隆形成实验检测鼻咽癌细胞集落形成能力;通过流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的改变;使用Transwell小室系统检测鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力;通过血管拟态形成实验检测鼻咽癌细胞的血管成管现象;通过建立裸鼠皮下荷瘤模型,检测miR-203a-3p对鼻咽癌体内生长的影响;运用Western blot技术检测相关蛋白的表达水平。实验结果显示:miR-203a-3p的过表达可以抑制鼻咽癌细胞的增殖能力,并将鼻咽癌细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制鼻咽癌细胞的生长;同时miR-203a-3p能有效抑制鼻咽癌的体内生长;miR-203a-3p能显著抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力;同时miR-203a-3p的过表达可以减少鼻咽癌细胞血管成管现象和上皮间质转化现象。第三部分:为了探讨miR-203a-3p对鼻咽癌细胞恶性生物学行为抑制作用的机制,我们检测了miR-203a-3p的靶基因。通过检索生物信息学网站,发现VEGFC可以作为miR-203a-3p的直接靶基因。通过在鼻咽癌细胞系5-8F、C666-1中转染miR-203a-3p mimics,发现VEGFC的表达量明显降低,转染miR-203a-3p inhibit,VEGFC的表达量明显增多,表明miR-203a-3p能有效抑制VEGFC基因的表达。双荧光素酶报告实验结果显示miR-203a-3p和GLA-VEGFC-3蔝TR-wild质粒共转染抑制了荧光素酶活性,减弱荧光强度,表明VEGFC是miR-203a-3p的直接靶点。第一部分已经证实VEGFC在鼻咽癌组织和细胞系中高表达,可能起促癌基因的作用,为了探索VEGFC在鼻咽癌中的作用机制,通过平板克隆形成实验、流式细胞仪PI染色法、Transwell小室实验、血管拟态形成实验和Western blot等进一步研究VEGFC对鼻咽癌细胞恶性生物学作用的影响。实验结果显示:干扰VEGFC的表达明显抑制了鼻咽癌细胞的增殖、血管拟态形成和上皮间质转化现象,对鼻咽癌细胞的迁移、侵袭能力无明显影响。第四部分:为了进一步探索miR-203a-3p/VEGFC对鼻咽癌调节作用的机制,运用Western blot检测了鼻咽癌细胞PI3K/AKT信号通路中相关蛋白表达情况。首先验证了干扰VEGFC的表达,能显著下调p-AKT的表达水平,同时上调AKT蛋白的表达。随后又发现miR-203a-3p过表达,能显著下调VEGFC、p-AKT的蛋白水平,同时上调AKT蛋白的表达;抑制miR-203a-3p的表达,VEGFC表达上调,下调AKT的表达下调,同时上调p-AKT蛋白的表达,表明miR-203a-3p可以通过下调VEGFC的表达调节PI3K/AKT信号通路的活性。结论:miR-203a-3p在鼻咽癌中低表达,通过直接结合VEGFC的3蔝TR区抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭、血管拟态形成和上皮间质转化现象。miR-203a-3p可以通过下调VEGFC的表达调节PI3K/AKT信号通路的活性。
【图文】：

VEGFC在鼻咽癌组织中的表达量在鼻咽癌细胞系中VEGFC的表达量明显升高

VEGFC在鼻咽癌细胞中的表达量免疫荧光结果显示VEGFC在鼻咽癌组织中的表达水平较非肿瘤组织明显
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63

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本文编号：2634424