罂粟碱对视网膜小胶质细胞活化的影响及其作用机制的研究

发布时间：2020-04-22 03:23

【摘要】：研究背景与目的视神经损伤会引起RGC轴突凋亡及胶质化反应,导致RGC轴突再生障碍,造成不可逆的视觉损伤。异常活化的小胶质细胞释放大量细胞毒性因子如TNF-α,IL-1β,NO和ROS,对RGC造成二次损伤。本课题组预实验发现罂粟碱能够抑制原代视网膜小胶质细胞释放炎症因子,抑制其活化。cAMP与哺乳动物中枢神经元的发育、存活及轴突再生密切相关,在许多信号传导途径中发挥关键作用。Woo等人发现,提高cAMP的含量能够活化PKA,从而抑制BV2细胞释放炎症介质IL-1β。MAPK/Erk级联信号参与小胶质细胞的活化。Park等发现,岩藻依聚糖通过下调MAPK(ERK,JNK,p38)途径和Akt途径减弱LPS诱导的BV2小胶质细胞中iNOS,COX-2,IL-1β和TNF-α的表达。PI3K在细胞生长,粘附,分化和炎症反应中具有重要作用。为探究罂粟碱抑制视网膜小胶质细胞激活的机制,本课题组分析罂粟碱对cAMP/PKA,MEK/Erk,PI3K/Akt通路的影响,以及各通路对于小胶质细胞释放TNF-α,IL-1β和IL-10的作用,并探究各信号通路之间的关系,为罂粟碱抑制小胶质细胞活化、保护中枢神经系统提供理论依据和实验依据。1材料与方法1.1研究材料分离纯化新生SD大鼠的原代视网膜小胶质细胞,建立LPS诱导的小胶质细胞活化模型。1.2研究方法用RT-PCR和ELISA分别检测TNF-α,IL-1β和IL-10的转录和蛋白质表达水平,观察视网膜小胶质细胞的异常活化情况。用western blot检测信号通路的蛋白质磷酸化水平,观察各通路活化情况。分别加入cAMP抑制剂Rp-isomer,PKA抑制剂H89,MEK抑制剂U0126和PI3K抑制剂LY294002,进一步研究各通路在罂粟碱抑制原代视网膜小胶质细胞活化中的作用以及各信号通路之间的关系。2结果2.1罂粟碱抑制TNF-α和IL-1β,促进IL-10的转录和蛋白质表达2.2罂粟碱通过激活cAMP/PKA通路来抑制TNF-α和IL-1β的蛋白质表达罂粟碱上调cAMP含量,添加Rp-isomer和H89阻断cAMP/PKA通路,TNF-α和IL-1β的蛋白质表达增加。2.3罂粟碱抑制MEK/Erk信号通路LPS上调MEK和Erk的磷酸化表达,这些效果被罂粟碱阻断。2.4 U0126减弱炎症因子TNF-α和IL-1β的转录和蛋白质表达LPS增加TNF-αmRNA和IL-1βmRNA,上调TNF-α和IL-1β的蛋白质表达,添加U0126显著抑制以上效果。2.5 U0126增加抗炎因子IL-10的转录和蛋白质表达2.6 MEK/Erk通路受cAMP/PKA的部分调节添加Rp-isomer和H89阻断cAMP/PKA通路,MEK和Erk的磷酸化水平增加。2.7罂粟碱激活PI3K/Akt通路,有抑制小胶质细胞活化的趋势罂粟碱上调PI3K和Akt的磷酸化水平,使用LY294002后TNF-α和IL-1β的表达出现增加趋势。3结论罂粟碱通过cAMP/PKA和MEK/Erk通路抑制LPS诱导的原代视网膜小胶质细胞活化,并且MEK/Erk通路受cAMP/PKA通路的部分调节。
【图文】：

图 1 IBA-1 鉴定原代视网膜小胶质细胞分离、纯化 SD 乳鼠视网膜小胶质细胞，固定，进行 IBA-1 染色，观察不同视野的 IBA-1阳性细胞，细胞呈多角、类圆形。2.2 罂粟碱抑制 TNF-α 和 IL-1β 的转录和蛋白质表达，促进 IL-10的转录和蛋白质表达预置不同浓度的罂粟碱（0.4, 2, 10μg/ml）处理细胞 4 h，再加入 100ng/ml的 LPS 孵育 24 h。收集细胞，用 RT-PCR 方法检测各因子 mRNA 的表达水平；收集上清液，用 ELISA 方法检测各炎症因子蛋白质表达水平。如图 2 所示，生理状态下，，原代视网膜小胶质细胞中 TNF-α、IL-1β 的转录水平（图 2a）和蛋白质表达水平（图 2b）是极低的，LPS 刺激小胶质细胞后，显著上调 TNF-α、IL-1β 的转录和蛋白质表达，而不同浓度的罂粟碱能够降低TNF-α、IL-1β 的转录和蛋白质表达（n=5，与 LPS 组相比，*P＜0.05，**P＜0.01）。如图 3 所示，生理状态下，原代视网膜小胶质细胞中 IL-10 的 mRNA 表达

17图 2 罂粟碱抑制小胶质细胞 TNF-α 和 IL-1β 的转录和蛋白质表达预置不同浓度的罂粟碱（0.4, 2, 10μg/ml）处理细胞 4 h，再加入 100ng/ml 的 LPS 孵育24 h。LPS 显著上调 TNF-α、IL-1β 的转录（a）和蛋白质表达（b），不同浓度的罂粟碱能够降低 TNF-α、IL-1β 的转录和蛋白质表达（n=5），与 LPS 组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。图 3 罂粟碱促进小胶质细胞 IL-10 转录和蛋白质表达
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774

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本文编号：2636080