下咽鳞状细胞癌中S100A4和PAFAH1B3的表达及其作用的初步研究

发布时间：2020-04-30 13:06

【摘要】：第一部分:S100A4的表达对下咽鳞状细胞癌预后、迁移和侵袭的预测作用的初步研究研究背景和目的下咽鳞状细胞癌是恶性程度最高的头颈部肿瘤之一。局部颈部淋巴结转移是下咽鳞状细胞癌预后不佳的重要因素之一:大约有60-80%的患者伴有同侧颈部淋巴结转移,而高达40%的病例会出现隐匿性淋巴结转移。同时,出现淋巴结转移的下咽鳞状细胞癌易发生局部复发和远处转移,后两者也是其预后不佳的重要因素。虽然,包括下咽鳞状细胞癌在内的头颈肿瘤中,已有相当数量的文献报道了转移相关的信号通路或介导分子,但是其转移机制尚不明确。因此,在分子生物学基础上研究新的分子标志物和治疗靶点,提出对于抑制肿瘤转移效果更好的治疗手段,是目前亟须解决的课题。S100A4属于钙结合蛋白S100家族,是近年来广泛研究的转移相关蛋白。通过不同的动物模型实验证实,S100A4是促进肿瘤发生转移、扩散的重要介导因子。S100A4参与了多个的介导肿瘤细胞转移的信号通路,如上皮-间质转化通路(epithelial-mesenchymal transition,EMT),Wnt/β-catenin信号通路,Rage/NF-κB通路,ERBB2信号通路等。S100A4几乎在所有的细胞类型中均有不同程度的表达,在发挥细胞内功能的同时,又可以共价二聚体的形式分泌到细胞外发挥作用。因此,S100A4还可以通过促进血管浸润,调节基质金属蛋白酶活性,介导肿瘤细胞和基质细胞的交互作用,激发免疫细胞的募集,来改变肿瘤微环境,从而促进肿瘤的扩散和转移。S100A4被证实在多种肿瘤组织中呈现高表达,并与肿瘤的淋巴结转移,TNM分期,病理分级等临床病理特征高度相关。在结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌等多种实体肿瘤中,S100A4蛋白表达可作为重要的预后预测因子。在头颈肿瘤中,S100A4在颊黏膜癌和舌癌中发生和发展起到重要作用。但是,S100A4在下咽鳞状细胞癌中的表达和作用尚不明确。因此,本课题旨在:1)研究S100A4在下咽鳞状细胞癌肿瘤和癌旁正常组织中的表达情况,及其与临床病理特征和预后的关系。2)通过体外细胞实验,探讨S100A4对下咽鳞状细胞癌FaDu细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭中的作用,进一步证实其在在下咽鳞状细胞癌中促进转移的作用。研究方法本课题首先通过免疫组化染色的方法测定了 S100A4在下咽鳞状细胞癌肿瘤(n=71)和癌旁正常组织(n=44)中S100A4的表达情况,并按照染色强度和比例的评分标准分别对S100A4蛋白在细胞质和细胞核内的表达进行半定量测定,所得的最终评分并用于进一步的数据分析。在71例下咽鳞状细胞癌患者样本中,有44例肿瘤样本具有配对的癌旁非肿瘤组织,即正常组织样本,利用配对Wilcoxon秩和检验对44对肿瘤和癌旁正常组织的S100A4表达的评分进行统计学分析,比较S100A4在下咽鳞状细胞癌肿瘤和癌旁正常组织中表达水平的差异。卡方或者Fisher精确检验则用于分析S100A4表达水平与下咽鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系。Kaplan-Meier生存分析用于研究S100A4表达与下咽鳞状细胞癌患者预后之间的关系。Cox模型单因素和多因素分析用于进一步研究细胞核S100A4表达与下咽鳞状细胞癌患者预后之间的关系。在体外细胞实验中,人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系作为细胞模型进行如下实验:利用S100A4特异性siRNA转染FaDu细胞,使FaDu细胞中S100A4的表达显著下降,并进一步进行CCK-8细胞增殖实验、划痕迁移实验、Transwell迁移和侵袭实验、细胞凋亡检测和细胞周期检测。实验组和对照组的差异通过Mann-Whitney U检验分析。数据用mean士SD表示。P0.05时表示具有统计学意义。所有统计学分析为双侧。研究结果1.与癌旁正常组相比,S100A4在下咽鳞状细胞癌肿瘤中的表达显著上调(P0.0001)。在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织中,S100A4广泛分布于肿瘤细胞以及间质细胞中,而本研究主要分析的是S100A4在肿瘤细胞内的表达。免疫组织化学染色结果显示S100A4在下咽鳞状细胞癌肿瘤细胞的细胞质和细胞核中均有表达。其中,57例(80%,57/71)下咽鳞状细胞癌肿瘤为S100A4高表达,并且所有高表达样本均有S100A4细胞质高表达,仅有20例(28%,20/71)样本同时具有S100A4细胞核高表达。2.在下咽鳞状细胞癌中,S100A4表达与患者临床病理特征之间的关系分析结果如下:S100A4细胞质高表达与颈部淋巴结转移(P=0.007)和分化程度较低(P=0.028)显著相关,但与患者的性别、年龄、肿瘤分期(T)和临床TNM分期无关。S100A4细胞核高表达与颈部淋巴结转移(P=0.017)、临床TNM分期进展(P=0.046)以及分化程度较低(P=0.042)显著相关,与患者年龄、性别、肿瘤分期(T)无关。3.Kaplan-Meier生存分析结果显示,S100A4细胞质高表达组患者的总体生存要低于低表达组,但差异不具有统计学意义(P=0.071);而S100A4细胞核高表达组患者的总体生存显著低于低表达组,且具有统计学意义(P0.001)。Cox回归模型单因素和多因素分析结果显示S100A4细胞核高表达是下咽鳞状细胞癌的独立预后因素(HR,2.6;95%CI,126-5.37,P0.001)。4.进一步分析S100A4细胞核表达在不同临床TNM分期亚组中与预后的关系的结果显示:在中晚期(TNM Ⅲ+Ⅳ期)患者中,S100A4细胞核高表达组的总体生存显著低于低表达组,具有统计学意义(P=0.001),然而在早期(TNM Ⅰ+Ⅱ)患者中,S100A4细胞核高表达组和低表达组之间的总体生存无明显差别(P=0.101)。5.体外实验结果显示,与阴性对照组(Negative control,NC)相比,FaDu细胞转染S100A4特异性siRNA后,其S100A4的表达水平显著降低(P=0.0101)。划痕迁移实验结果显示FaDu细胞在S100A4敲低后细胞伤口愈合的速度较NC组显著下降(P0.0001)。Transwell迁移实验结果显示S100A4干扰组穿过Transwell小室滤膜的FaDu细胞较NC组显著减少(P=0.032)。Transwell侵袭实验结果显示S100A4干扰组穿过Matrigel基质胶以及Transwell小室滤膜的FaDu细胞明显少于NC组穿过的细胞数(P0.0171)。因此,S100A4的敲低可抑制FaDu细胞的迁移和侵袭能力。6.细胞周期实验结果显示,S100A4干扰组在细胞周期G0/G1期的细胞聚集较NC组上升(P0.01),但CCK-8细胞增殖实验和细胞凋亡实验结果显示S100A4的敲低对FaDu细胞的增殖和凋亡无明显影响(P值分别为0.0987和0.5948)。研究结论和意义S100A4在下咽鳞状细胞癌肿中高表达,并与淋巴结转移高度相关。此外,S100A4细胞核高表达是下咽鳞状细胞癌的独立预后影响因素。在体外细胞实验中,敲低S100A4可以显著削弱FaDu细胞的迁移和侵袭能力。本研究不仅提供了新的下咽鳞状细胞癌的预后因子,也提供了新的治疗靶点。第二部分:下咽鳞状细胞癌中PAFAH1B3异常表达与预后的相关性及其对增殖和侵袭影响的初步研究研究背景和目的颈部淋巴结转移是下咽鳞状细胞癌局部复发及预后不佳的主要因素之一。转移相关分子生物学研究发现,基因突变和肿瘤微环境变化等会对细胞内的多种信号传导通路产生影响,并且,主要的致癌信号通路最后都汇集到癌细胞代谢。而肿瘤细胞代谢异常,可以使它们保持高增殖速率,抵抗某些细胞死亡信号。癌细胞的代谢改变和适应创造了对肿瘤细胞生长、存活和关键代谢通路必备的表型,而这些改变的机制包括某些酶的表达改变、基因突变以及转录后失活或者被异构体替代。因此,靶向肿瘤代谢相关分子的癌症治疗引起了越来越多的重视,一些靶向代谢通路的药物已进入临床试验阶段。血小板激活因子乙酰水解酶 1B3(platelet-activating factor aceltyhydrolase 1B3,PAFAH1B3)是血小板激活因子乙酰水解酶(platelet-activating factor aceltyhydrolase,PAFAH)的催化亚基之一。最近,Nilsson等在对19种癌症类型的1000多个原发肿瘤的研究中发现PAFAH1B3是最常见的50个肿瘤相关高表达代谢酶之一,这也提示着PAFAH1B3可能在其他类型中的肿瘤也起着重要作用。并且,PAFAH1B3在多种肿瘤中也出现异常表达。PAFAH1B3还可以通过调节具有抑癌作用的脂质分子来维持肿瘤细胞的侵袭性。并且,PAFAH1B3可以参与到多种信号通路的调节,包括PAF信号通路,Wnt信号通路,以及reelin信号通路。另外,在BCR-ABL1+BCP-ALL治疗中,PAFAH1B3可以作为酪氨酸激酶抑制剂联合治疗的靶向分子。虽然PAFAH1B3在肿瘤发生发展的作用越来越多的被人们认识,但是其在下咽鳞状细胞癌中的作用尚不明确,包括PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌中有什么的临床意义以及是否可以影响下咽癌细胞的生物学功能。因此,本课题旨在探讨PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达情况,并分析PAFAH1B3的表达和下咽鳞状细胞癌临床病理特征及总体生存之间的关系;此外,通过细胞学实验,研究PAFAH1B3在人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系中的生物学作用。研究方法本课题首先通过免疫组化染色的方法测定了PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织(n=83)和癌旁正常组织(n=44)中PAFAH1B3的表达情况,并按照染色强度和比例的评分标准对PAFAH1B3蛋白的表达进行半定量测定,所得的最终评分并用于进一步的数据分析。通过配对Wilcoxon秩和检验对44对肿瘤组织和癌旁正常组织PAFAH1B3表达的评分进行统计学分析,比较PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织和癌旁正常组织中表达水平是否具有差异。卡方或者Fisher精确检验则用于分析PAFAH1B3表达水平与患者临床病理特征之间的关系。Kaplan-Meier生存分析和Cox模型回归分析用于分析PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌预后中的作用。在体外细胞实验中,利用两条靶向PAFAH1B3的siRNA转染FaDu细胞以敲低PAFAH1B3的表达。CCK-8细胞增殖实验、伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验、细胞凋亡检测和细胞周期检测用于分析PAFAH1B3敲低后FaDu细胞表型的改变。实验组和对照组的差异通过student's t检验分析。数据用mean±SD表示。P0.05时表示具有统计学意义。研究结果1.PAFAH1B3主要分布下咽鳞状细胞癌肿瘤细胞的细胞质中。在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织中,有62.7%(52/83)的样本为PAFAH1B3高表达,而在癌旁正常组织中,仅有22.7%(10/44)的样本为PAFAH1B3高表达。PAFAH1B3在肿瘤组织中高表达的比例显著高于癌旁正常组织中高表达的比例,具有统计学意义(P0.0001)。并且,配对的下咽鳞状细胞癌肿瘤组织和癌旁正常组织(n=44对)PAFAH1B3表达水平的分析结果显示,PAFAH1B3在下咽鳞状细胞肿瘤组织中的表达显著上调(P0.0001)。2.卡方或者Fisher精确检验分析结果显示,PAFAH1B3高表达与下咽鳞状细胞癌局部淋巴结转移以及临床TNM分期进展高度相关(P值分别为0.010和0.032),但与患者年龄、性别、是否吸烟、是否饮酒、肿瘤分期(T)以及分化程度无明显相关性。Kaplan-Meier生存分析结果显示PAFAH1B3高表达组患者的总体生存要显著低于低表达组,二者差别具有统计学意义(P=0.022)。但是,Cox回归多因素分析结果显示,PAFAH1B3的表达不是下咽鳞状细胞癌的独立预后因素(HR,1.73;95%CI,0.86-3.47;P=0.123)。3.在体外实验中,我们采用PAFAH1B3特异性小干扰(PAFAH13-siRNA1和PAFAH1B3-siRNA2)转染FaDu细胞。结果显示与NC组相比,转染PAFAH1B-siRNA1的实验组1和转染PAFAH1B3-siRNA2的实验组2的FaDu细胞PAFAH1B3表达降低。4.CCK-8细胞增殖实验结果显示,PAFAH1B3敲低显著抑制FaDu细胞的细胞增殖(siRNA1 vs NC:P=0.0001;siRNA2 vs NC:P=0.0046)。细胞凋亡实验结果显示,经过PAFAH1B3特异性小干扰处理的实验组较NC组的早期凋亡细胞比例显著升高(siRNA1 vs NC:P=0.0002;siRNA2 vs NC:P=0.0061),而凋亡标志物c-PARP的表达明显升高。细胞周期实验中,实验组在G1期的细胞比例有所增加(siRNA1 vs NC:P=0.0106;siRNA2 vs NC:P=0.0192),在 S期的细胞比例有所减少(siRNA1 vs NC:P=0.0196;siRNA2 vs NC:P=0.0376)。5.伤口愈合实验结果显示,经过靶向PAFAH1B3小干扰处理的实验组1和实验组2的FaDu细胞愈合率均显著低于NC组(siRNA1 vs NC:P=0.0012;siRNA2 vs NC:P=0.0039)。Transwell迁移实验结果显示,转染PAFAH1B3靶向小干扰的实验组中,穿过Transwell小室滤膜的FaDu细胞数较NC组显著减少(siRNA1 vs NC:P=0.0005;siRNA2 vs NC:P=0.0017)。Transwell侵袭实验结果显示,转染PAFAH1B3特异性小干扰后穿过Matrigel基质胶和Transwell小室滤膜的FaDu细胞要显著少于NC组(siRNA1 vs NC:P=0.0002;siRNA2 vs NC:P=0.0013)。研究结论和意义综上所述,PAFAH1B3在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织中高表达,并且与局部淋巴结转移以及患者的预后密切相关。此外,PAFAH1B3敲低在FaDu细胞中可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,降低细胞的迁移和侵袭能力,并且对细胞周期有调节作用。因此,我们认为PAFAH1B3可能作为下咽鳞状细胞癌治疗的新的靶点分子。
【图文】：

鳞状细胞癌,阴性,肿瘤,情况

１．低倍镜（２０Ｘ）和高倍镜（４０Ｘ）下Ｓ１００Ａ４在下咽鳞状细胞癌（ＨＳ瘤和癌旁正常组织中的ＩＨＣ染色情况的代表图。逡逑ＩＨＣ染色显示Ｓ１００Ａ４在ＨＳＣＣ癌旁正常组织的阴性表达（－）代表图逡逑逦ＩＨＣ染色显示Ｓ１００Ａ４在ＨＳＣＣ肿瘤的阴性表达（－）代表图逡逑

鳞状细胞癌,肿瘤,视野,图片

逦山东大学博士学位论文Ｃ．逦ＩＨＣ染色显示Ｓ１００Ａ４在ＨＳＣＣ肿瘤弱阳性表达（＋邋）代表图逡逑Ｄ．逦ＩＨＣ染色显示Ｓ１００Ａ４在ＨＳＣＣ肿瘤强阳性表达（＋＋）代表图逡逑左边一列为低倍镜视野下的图片（２０Ｘ），，右边一列为高倍镜视野下的图片（４Ｘ邋），低倍镜和高倍镜下的比例尺及其代表的长度在１Ａ中显示。逡逑缩写：ＨＳＣＣ，邋ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ邋ｓｑｕａｍｏｕｓ邋ｃｅｌｌ邋ｃａｒｃｉｎｏｍａ（下咽鳞状细胞癌）。ＩＨＣｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ邋（免疫组织化学）逡逑－逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63

【相似文献】