MKL1 调节高糖诱导的视网膜色素上皮细胞间充质转化的机制研究

发布时间：2020-05-04 20:44

【摘要】：糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见且最具破坏性的并发症之一,影响约1/3的糖尿病患者,是导致劳动年龄人口和老年人口视力下降的重要原因。糖尿病视网膜病变的进展及恶化与糖尿病的长期病程、血糖控制差等危险因素密切相关。当暴露于高糖环境中时,视网膜色素上皮细胞(RPEs)在形态和功能上都会发生显著的改变,表现为上皮-间充质转换(EMT)。高糖诱导视网膜色素上皮细胞间充质转化的机制尚不完全清楚。巨核细胞性白血病因子1(MKL1)是一种转录调节因子,又被称作为骨髓来源的急性白血病因子(MAL),或者是心肌相关转录因子(MRTF-A)。我们的研究发现,用25m M葡萄糖处理过的视网膜色素上皮细胞发生了上皮间充质转化的过程,其特征表现为E-钙粘蛋白(由CDH1编码)表达下调的同时α平滑肌肌动蛋白(由ACTA2编码)的表达上调。高糖环境诱导的视网膜色素上皮细胞向间充质细胞转化的过程中,同时伴随着MKL1表达增多并且在细胞核富集增强。相反,当使用小片段干扰核苷酸(si RNA)敲除或小分子化合物CCG-1423抑制MKL1后,高糖环境下视网膜色素上皮细胞向间充质细胞转化的过程被抑制。在视网膜色素上皮细胞对高糖环境刺激的应答中,另一个有趣的现象是,MKL1介导了间充质标志物赖氨酰氧化酶(LOX)的转录激活。从机制上讲,转录因子AP-1与MKL1相互作用,并且招募MKL1到LOX的近端启动子上,通过改变染色质结构来促进LOX的转录激活。最后,使用si RNA敲低LOX或通过氨基丙腈抑制LOX时,可消除高糖环境诱导的网膜色素上皮细胞向间充质转化的进程。结论,我们的实验结果表明,MKL1通过表观遗传机制调控LOX的转录激活,从而介导了高糖环境诱导的视网膜色素上皮细胞向间充质细胞转化的过程。
【图文】：

视网膜色素上皮,葡萄糖,间充质,上皮

图 2：高葡萄糖水平诱导视网膜色素上皮发生上皮间充转化的过程中，MKL1 发挥了重要的作用（A）RPEs 通过 siRNA 干扰 MKL1 后，给予高浓度的葡萄糖处理，，48h 后通qPCR 方法检测 MKL1、CDH1、ACTA2 基因的表达量（B）RPEs 通过 siRNA 干扰 MKL1 后，给予高浓度的葡萄糖处理，48h 后通免疫印迹方法检测 MKL1、E 钙粘蛋白、α-sma 蛋白的表达量（C）ChIP 实验，给予 SNAIL 抗体，观察 SNAIL 与 CDH1 启动子结合的情（D）ChIP 实验，给予 SMAD3 抗体，观察 SMAD3 与 ACTA2 启动子结合的况（E）RPEs 给予高浓度的葡萄糖同时给与 MKL1 的抑制剂 CCG-1423 后，通qPCR 方法检测 CDH1、ACTA2 基因的表达水平（F）RPEs 给予高浓度的葡萄糖同时给与 MKL1 的抑制剂 CCG-1423 后，通

免疫印迹,方法,靶点,报告基因

图 3：MKL1 通过激活 LOX 转录来应答高糖对视网膜色素上皮细胞的刺激（A）以 MKL1 或 SCR 为靶点的 siRNA 干扰 RPEs 后，予以高糖处理 48h。通过 qPCR 方法检测 LOX 基因的表达水平（B）处理同 A，通过免疫印迹方法检测 LOX 蛋白的表达水平（C）使用 CCG-1423 或不使用 CCG-1423 对 RPEs 进行高糖处理。通过 qPCR方法检测基因的表达水平（D）处理同 C。通过免疫印迹方法检测蛋白的表达水平（E）将不同长度的 LOX 启动子构建体，含有 MKL1 或不含有 MKL1，转染到HEK293 细胞中。报告基因激活试验通过蛋白浓度和 GFP 荧光值来校正（F）对 RPEs 予以高糖（25mM）处理，并在指定的时间点收集细胞。使用抗MKL1 抗体进行 ChIP 实验
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1

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