眼眶周脂肪来源间充质干细胞对视网膜祖细胞增殖和分化的影响机制研究

发布时间：2020-05-09 02:48

【摘要】：目的:视网膜退行性疾病,包括年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP),是一种严重的视力损伤性疾病。该病主要由视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞进行性凋亡或坏死引起,目前尚无有效治疗方法。研究证明细胞替代疗法可以替代受损的细胞或营养支持凋亡的细胞,因此成为最有希望治疗视网膜退行性疾病的方法。视网膜祖细胞(Retinal Progenitor Cells,RPCs),是一种分离于发育中视网膜组织的一类干/祖细胞。视网膜祖细胞不仅能够自我更新而且能够定向分化成视网膜各级细胞,应用更加简单,无需长时间诱导过程,更加安全,成为细胞替代疗法中最有希望临床转化应用的种子细胞。然而视网膜祖细胞体外扩增效率和定向分化成神经视网膜细胞是目前研究面临的主要问题。先前研究证明间充质干细胞分泌蛋白组中含有神经营养因子和活性细胞因子,可以通过旁分泌作用促进多种细胞的增殖和分化。眼眶周脂肪来源间充质干细胞(human eyelid adipose-derived stem cells,HEASCs)做为一种神经外胚层来源的自体干细胞,具有修复组织损伤的潜能。因此本研究探究了眼眶周脂肪来源间充质干细胞和脐带间充质干细胞条件培养基对视网膜祖细胞增殖、贴壁和分化的影响,进一步通过抗体芯片分析了两种不同来源的间充质干细胞条件培养基中分泌蛋白组的差异,初步探索间充质干细胞条件培养基促进视网膜祖细胞向视网膜感光细胞分化的因子及机制。研究方法:利用外植体方法分离和培养了不同年龄眼眶周脂肪来源间充质干细胞,并比较了不同年龄组眼眶周脂肪来源间充质干细胞在体外的增殖能力,通过流式细胞仪、Real-time PCR和细胞分化能力鉴定和比较了不同年龄组眼眶周脂肪来源间充质干细胞的表面标志物的表达和多向分化能力的差异。然后分别收集了在神经营养因子刺激条件下眼眶周脂肪来源间充质干细胞和脐带来源间充质干细胞条件培养基,用于培养体外分离的视网膜祖细胞,利用MTT、细胞周期检测和Real-time PCR评估间充质条件培养基对视网膜祖细胞体外增殖和贴壁的影响;细胞免疫荧光和Real-time PCR检测了在无外源血清诱导物和有血清诱导情况下实验组培养基对视网膜祖细胞分化的影响。为了寻找间充质干细胞促b进视网膜祖细胞体外增殖和分化的机制,实验利用抗体芯片检测了两种间充质干细胞条件培养基中分泌因子的表达情况;我们选择差异表达的细胞因子Activin A,并观察Activin A对视网膜祖细胞增殖的和分化的影响,从而初步探究参与Activin A对视网膜祖细胞分化的信号通路。结果:利用外植体方法成功提取了不同年龄的眼眶周脂肪来源间充质干细胞。经过外植体培养,3天左右可见少量细胞从组织周围爬出,贴壁生长,呈现双极杆状,折光性强,成纤维样细胞形态,3-20天内全部组织均可见细胞生长。CCK-8细胞增殖实验和克隆形成实验证明了年龄对眼眶周脂肪来源间充质干细胞呈副作用,年龄增长HEASCs体外增殖能力减弱;流式细胞比较表面标记物表明,不同年龄眼眶周脂肪来源间充质干细胞均高表达CD105、CD44、CD73,低表达CD34、CD45、CD31,而CD90的表达各年龄段具有显著差异;体外培养发现,随着年龄的增长HEASCs成骨和成软骨分化能力下降,而成脂肪分化能力增强;视网膜祖细胞培养在收集的两种间充质干细胞条件培养基中,观察到间充质干细胞条件培养基能够促进RPCs细胞增殖,促进细胞进入S和G2期,间充质干细胞条件培养基同时促进RPCs高表达增殖标志物Ki67;在两种来源的间充质干细胞条件培养基作用下,RPCs高表达视网膜相关细胞标志物NF,Recoverin和Rhodopsin,证明了两种来源间充质干细胞条件培养基促进视网膜祖细胞特异性分化;在胎牛血清诱导剂存在下,两种来源间充质干细胞条件培养基更显著促进视网膜祖细胞表达NF,Recoverin和Rhodopsin;抗体芯片检测结果表明,两种不同来源的间充质干细胞条件培养基共检测到230个因子表达,其中包括生长因子、细胞因子、趋化因子、细胞受体因子和炎性因子等;两种不同来源的间充质干细胞共表达因子109个,只在HEASCs上清液中表达的因子有62个,只在UMSCs中表达的因子有59个;抗体芯片结果显示,Activin A只在眼眶周脂肪来源间充质干细胞条件培养基中高表达。在RPCs培养基中添加不同浓度的Activin A,发现Activin A存在下促进RPCs的增殖作用与对照组相比无显著差异;细胞免疫荧光实验进一步发现,Activin A存在下可显著促进视网膜祖细胞向视网膜感光细胞分化,显著性高表达视网膜感光细胞特异性标志物,同时Western blot实验也证明Recoverin和Rhodopsin蛋白高表达;Western blot实验进一步证明在Activin A刺激视网膜祖细胞后,p-Akt和p-Erk表达较未刺激组增高,加入PI3K/AKT抑制剂后p-Akt、p-Erk、Recoverin和Rhodopsin的表达均显著下降,说明PI3K/AKT/ERK信号通路参与Activin A对视网膜祖细胞的分化调控作用。结论:通过外植体方法成功提取了不同年龄眼眶周脂肪来源间充质干细胞,随着年龄增长,眼眶周脂肪来源间充质干细胞体外增殖能力减弱,眼眶周脂肪来源间充质干细胞的成骨和成软骨分化能力减弱,而成脂分化能力不受影响。利用眼眶周脂肪和脐带来源的间充质干细胞条件培养基培养视网膜祖细胞可以促进视网膜祖细胞体外增殖、贴壁和向视网膜感光细胞分化。抗体芯片发现眼眶周脂肪来源间充质干细胞条件培养基中高表达Activin A,当Activin A存在下,可以促进视网膜祖细胞向视网膜感光细胞显著分化,并且PI3K/AKT/ERK信号通路参与Activin A促进视网膜祖细胞向视网膜感光细胞的分化过程的调控。
【图文】：

外植体法分离眼眶周脂肪来源间充质干细胞形态

HEASCs体外生长增殖情况
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.1

【参考文献】

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本文编号：2655474