一例STGD家系致病基因的鉴定及在角膜营养不良中的潜在作用

发布时间：2020-05-13 03:12

【摘要】：目的应用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)技术鉴定1个中国Stargardt(stargardt macular dystrophy,STGD)病家系中与疾病相关的突变,扩展现有的致病突变谱,并进一步确定基因型-表型相关性。方法收集中国STGD病家系和200名正常对照。记录先证者及其姐姐的临床资料,询问记录病史及家族史,进行眼科一般检查和特殊检查,包括眼底彩色照相、黄斑区相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)及视野检查。静脉采集患者及家庭成员外周血,用Blood DNA Kit试剂盒提取DNA并进行检测,检测合格后应用Illumina HiSeq2500测序平台进行全外显子组测序,并分析其生物流程,进行变异检测及注释。通过数据位点的整合、过滤、功能预测结合常染色体隐性遗传模式分析以发现致病基因突变。运用Sanger测序技术对家系成员行突变分析,完成一代测序的确认。继而针对200名健康对照通过高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)方法进行突变的筛查,进一步排除多态性位点。通过ProtParam工具计算突变体和野生型蛋白质的物理化学参数蛋白质结构和功能预测。SMART在线软件进行蛋白结构域在线分析。HOPE在线软件用于分析突变的结构效应。应用健康C57小鼠,进行免疫荧光染色和免疫蛋白印迹法(western blot,WB),检测上述基因的蛋白表达水平,运用实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction,PCR)技术检测mRNA的表达情况。分析小鼠视网膜中ABCA4的含量情况。结果先证者及其姐姐眼底彩色照相可见,眼底形态以黄斑区不同程度、范围的萎缩和眼底黄色斑点分布为特点。黄斑区OCT可见黄斑区神经上皮厚度变薄。视野检查显示中心暗点与局部暗点,合并视野缺损。使用WES,鉴定了ABCA4基因中的新的纯合突变(NM_000350:c.G3190C,p.G1064R)。该突变在家系中与表型共分离。在200个不相关的健康对照中没有检测到该突变,并且在任何数据库都没有记录,说明是一个新的突变。五种功能预测软件预测该突变为“有害”,并且在进化过程中高度保守。ABCA4的AAA ATP酶核心存在于氨基酸955至1145,而p.G1064R位于AAA结构域,可能迫使局部骨架形成不正确的构象,扰乱局部结构,降低ATP酶的活性,从而导致疾病发生。ABCA4在小鼠视网膜等眼组织中高度表达,在正常小鼠角膜组织中也有表达。结论我们鉴定了STGD位于ABCA4基因的一个新的致病突变(NM_000350:c.G3190C,p.G1064R)。该基因突变与家系表型共分离,软件功能预测为“有害”,并且在进化中高度保守,这都提示其致病性。本研究结果扩增了现有的致病突变谱,并进一步增强了对于基因型-表型相关性的认识。
【图文】：

结果的一般情况入中国血统的 1 个 Stargardt 病家系，对于家系患者年龄 13 岁，性别男，先证者姐姐 18 岁。否认姐均患有 Stargardt 病，父母没有患病，该谱系表传（图 1）。另外收集了 200 个与该疾病不相关视力逐渐下降 8 年。临床表现：眼部检查视力：裂隙灯显微镜检查眼前节，可见双眼眼睑无红肿深度中等，房闪（-），晶状体透明，双眼瞳孔圆体轻度混浊。先证者姐姐自述视力严重下降近 1 0.1，双眼矫正无助。

一例 STGD 家系致病基因的鉴定及在角膜营养不良中的潜在作用者及其姐姐的有详细的眼底检查结果，图 2 所示，，两人的眼底检查结两人即出现了眼底萎缩，又出现了眼底黄色斑点。可见先证者及其姐姐黄斑区萎缩，萎缩的程度范围形态各不相同，斑萎缩区可见色素紊乱及色素变动，可见清晰的黄色斑点。先证者姐可见黄斑区呈“青铜片状”或“牛眼状”外观，颜色黄白相间，可见萎缩，境界明显。点：先证者及其姐姐均可见明显的眼底黄色斑点。不但在黄斑萎缩中部视网膜也可发现黄斑的萎缩。黄色斑点有的类似于针尖样，有的条状，可见形状多种多样，较为复杂。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R772.2

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本文编号：2661283