莱菔硫烷通过激活Nrf2通路抑制NLRP3炎症小体的形成对糖尿病视网膜病变的保护作用研究

发布时间：2020-05-13 11:09

【摘要】：研究背景和目的:糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,也是主要的不可逆致盲眼病之一,近年来发病率不断上升。糖尿病视网膜病变的发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。既往研究证明,高血糖状态增加了视网膜组织和毛细血管的氧化应激反应,导致视网膜内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增加,同时糖尿病患者的抗氧化防御系统也受到损害;除此,过量的ROS也可以增加促炎因子的表达,激活炎症反应,炎症反过来进一步加剧了氧化应激反应,从而形成一个氧化应激和炎症的恶性循环。莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一种异硫氰酸盐,富含于十字花科蔬菜,如卷心菜、西兰花、萝卜等,具有很强的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。已有研究证实SFN对于糖尿病肾病和心肌病具有保护作用,但是它对糖尿病视网膜病变是否同样存在保护意义尚不清楚。Nrf2/ARE信号通路可介导多种抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的转录,是抗氧化机制中的关键通路。SFN是否会影响视网膜细胞中Nrf2/ARE信号通路尚需进一步研究。此外,据报道核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体可被氧化应激反应激活参与DR的病理过程。而Nrf2可以调节NLRP3炎症小体的活性,因此,有必要探讨Nrf2/ARE信号通路和NLRP3炎症小体是否共同参与了DR的发病机制。进一步阐明SFN是否能够通过激活Nrf2/ARE信号通路并抑制NLRP3炎症小体来阻止DR的发展,有助于探索新的药物靶点,为糖尿病视网膜病变设计更为合理的治疗方案提供依据。研究方法:雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)65 mg/kg,确诊为糖尿病的大鼠进行分组后,分别连续12周注射不同剂量的SFN(0.5 mg/kg/d或1 mg/kg/d)。大鼠视网膜Müller细胞暴露于25 mmol/L葡萄糖与2.5μmol/L SFN中进行体外培养。提取大鼠视网膜组织后,采用HE染色的方法进行组织学分析;其次采用ELISA法检测视网膜组织和Müller细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β三种炎症因子指标的变化;试剂盒法检测视网膜组织和Müller细胞中抗氧化物GSH、SOD和CAT的表达水平;Real-time PCR技术检测视网膜组织和Müller细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶-1(NQO-1)的mRNA表达水平;EMSA法检测视网膜组织中Nrf2/ARE在细胞核内的结合量的变化情况。然后采用Western blot检测视网膜组织和Müller细胞中Nrf2蛋白表达情况,其下游靶蛋白HO-1和NQO-1的表达水平以及NLRP3炎症小体的组成成分NLRP3,cleaved caspase-1 p20,ASC的变化情况。最后,通过沉默Müller细胞中Nrf2基因,进一步验证SFN通过Nrf2信号通路发挥抗氧化、抗炎以及调节NLRP3炎症小体的功能。结果:组织学检测发现SFN能够缓解糖尿病大鼠的视网膜病理改变程度,细胞排列较糖尿病组整齐,血管扩张减轻。神经节细胞数计数显示,SFN干预后增加了糖尿病大鼠视网膜神经节细胞数量,高剂量SFN组改善效果更为显著。此外,SFN干预后显著减少了STZ大鼠视网膜组织和高糖环境下Müller细胞中促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的生成,增强了抗氧化酶(GSH、SOD和CAT)的活性。并且,SFN增强了Nrf2在细胞核内的聚集和表达,提高了Nrf2下游两种主要抗氧化剂HO-1、NQO1的表达。另外,糖尿病大鼠的视网膜组织和高糖环境下的Müller细胞表达的NLRP3炎症小体各组分:NLRP3、cleaved caspase-1 p20、ASC较正常对照组大鼠显著增加,而SFN干预能够明显降低NLRP3炎症小体各组分蛋白表达。但沉默Müller细胞Nrf2基因之后,SFN处理对高糖环境下细胞的炎症指标、抗氧化物质水平及NLRP3炎症小体的形成无显著影响。结论:SFN可以通过激活Nrf2信号通路并抑制NLRP3炎症小体的形成增强高糖环境下的视网膜抗氧化应激能力并减轻炎症反应水平,从而对糖尿病视网膜病变起到一定的保护作用。
【图文】：

视神经节,病理学变化,糖尿病大鼠,视网膜神经节细胞

图 1 糖尿病大鼠视网膜组织病理学观察及视神经节细胞数量测大鼠视网膜病理学变化。B.视网膜神经节细胞层神经节细胞数量。数据以（n=3）。***p＜0.001 VS Control，#p＜0.05 VS STZ。表 2 大鼠视网膜神经节细胞层细胞计数平均数标准差对照组 24.00 4.00SFN1 组 23.80 4.44尿病组（STZ 组） 9.40 1.67SFN0.5+STZ 组 13.80 3.27SFN1+STZ 组 17.00 3.394 讨论

抗氧化酶,糖尿病大鼠,糖尿病,统计学意义

鼠视网膜组织中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低，且差异均具有统计学意义（p<0.05，，p<0.01）。说明糖尿病大鼠的视网膜组织炎症反应水平明显增加，SFN可显著降低糖尿病大鼠视网膜组织中炎症因子的释放。SFN 作为一种抗氧化物质，其抗炎的作用可能通过其他途径实现，这将在论文第三部分详细阐述。其次采用试剂盒方法检测视网膜组织的中 GSH 含量，SOD 和 CAT 活性。结果显示（图 2D-F），与正常对照组相比，SFN1 组大鼠视网膜组织中 GSH 含量，SOD和 CAT 活性无显著变化，而糖尿病组（STZ 组）大鼠视网膜组织中 GSH 含量，SOD和 CAT 活性显著降低，差异具有统计学意义（p<0.01）；与糖尿病组（STZ 组）相比，SFN0.5+STZ 组和 SFN1+STZ 组大鼠视网膜组织中 GSH 含量，SOD 和 CAT 活性明显增加，其中 SFN1+STZ 组差异更为显著（p<0.01）。说明在糖尿病高血糖状态下，视网膜组织的抗氧化防御系统遭到了破坏，ROS 的清除能力会被抑制，SFN处理可增强糖尿病大鼠视网膜的抗氧化能力，在一定程度上其作用呈现剂量依赖性。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1

【参考文献】