高糖经p38 MAPK途径调节视网膜微血管周细胞P2X7受体表达及炎症介质释放

发布时间：2017-03-25 19:16

  本文关键词：高糖经p38 MAPK途径调节视网膜微血管周细胞P2X7受体表达及炎症介质释放，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:选择性提取并鉴定原代牛视网膜微血管周细胞(BRPs),并选取P2或P3代BRPs为细胞模型来探讨高糖对BRPs P2X7受体表达及其下游p38 MAPK信号通路的激活,以及细胞炎性介质和粘附分子mRNA表达的作用和机理;并探讨视网膜微血管周细胞内的P2X7受体及其下游p38 MAPK信号通路之间是否存在相互影响。为糖尿病视网膜病变的早期防治提供新的实验证据和干预靶点。方法:1.将匀浆后的视网膜组织碎片,经250目细胞过滤膜过滤后,收集滤过的组织碎片,并利用I型胶原酶消化后再分别利用100目及300目的细胞过滤膜过滤,收集下层细胞,即可提取得到原代的牛视网膜微血管周细胞,并采用倒置相差显微镜观察视网膜毛细血管周细胞的形态。2.采用免疫细胞化学染色法,利用神经元-胶质抗原2(NG2)及波形蛋白(Vimentin)来进行牛视网膜微血管周细胞的鉴定。3.分别用5.6mM正糖,30mM高糖干预BRPs 24h;再分别加入100uM P2X7受体特异性激动剂BzATP干预1h;100uM P2X7受体拮抗剂A438079Hcl预干预BRPs 1h后再分别加用正糖及高糖干预BRPs 24h;10uM p38 MAPK信号通路阻断剂SB203580预干预BRPs 24h后分别采用正糖和高糖干预BRPs 24h。然后分别检测P2X7受体的mRNA表达以及蛋白的表达的水平,并检测高糖、BzATP及A438079Hcl干预后p38 MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平,明确高糖对P2X7受体表达的影响,以及P2X7受体与其下游p38 MAPK信号通路之间的相互作用;同时检测各组炎症因子IL-6及粘附分子ICAM-1的mRNA表达水平。结果:1.采用胶原酶消化牛视网膜组织团块,并且利用细胞筛网选择性过滤分离,可获得具有良好活性,并且可传代培养的原代视网膜微血管周细胞。周细胞在原代培养1天后,可见细胞贴壁生长且细胞状态良好;大量细胞于接种培养3-5天后从培养皿底迁移长出;5-7天后可见视网膜微血管周细胞呈长梭形生长并形成较大的克隆;8-11天后长成短梭形的周细胞逐渐呈融合形态,呈重叠生长。传代培养后,1小时周细胞贴壁。平均5-7天左右能够传代一次。原代牛视网膜微血管周细胞传代到第3代(P3)后逐渐开始出现老化状态。2.牛视网膜微血管周细胞阳性表达神经元-胶质抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)和波形蛋白(Vimentin);且阳性率大于98%。3.与对照组相比,高糖干预BRPs 24h后,高糖组周细胞膜上P2X7受体的mRNA和蛋白表达量均见明显增加(均P0.05)。4.用P2X7受体特异性激动剂BzATP分别干预正糖及高糖培养24小时后的周细胞,干预1小时后可见,高糖+BzATP组的IL-6及ICAM-1的mRNA表达水平较对照组及高糖组明显上调,差异具有统计学意义(均P0.05)。5.拮抗P2X7受体后,高糖+A438079Hcl组的周细胞其IL-6及ICAM-1的mRNA表达水平较高糖组明显降低(均P0.05)。6.与对照组相比,高糖组周细胞p38 MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平表达增加(均P0.05)。7.用A438079Hcl拮抗P2X7受体后可见,高糖+A438079Hcl组的p38 MAPK信号通路的磷酸化蛋白表达水平较高糖组明显降低(均P0.05)。8.用SB203580预干预周细胞24小时后见,高糖+SB203580组的P2X7受体表达量较高糖组明显降低;且高糖+SB203580组的IL-6及ICAM-1的mRNA表达水平较高糖组明显降低(均P0.05)。结论:1.经I型胶原酶消化,并分别利用250目、100目及300目的细胞筛网,选择性过滤分离视网膜组织后,所得细胞能持续培养并可传代,经细胞鉴定显示已成功分离出BRPs,且细胞纯度良好。2.第二代和第三代周细胞的生长状态能更好的适应于后续实验。3.P2X7受体拮抗剂能抑制高糖所致的p38 MAPK信号通路的磷酸化蛋白表达以及IL-6和ICAM-1的合成;而阻断p38 MAPK信号通路能抑制高糖所致的P2X7受体表达上调及IL-6和ICAM-1的合成。提示P2X7受体及其下游P38 MAPK信号通路互相影响并介导了高糖所致的视网膜周细胞炎性微环境的形成,共同参与构成了高糖-P2X7受体-P38 MAPK通路激活-炎性因子和粘附分子合成增多的恶性循环。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 牛视网膜微血管周细胞 P2X7 受体 p38 MAPK 炎性微环境
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、牛视网膜微血管周细胞的培养及鉴定15-22
• 1.1 材料与方法15-16
• 1.1.1 组织来源15
• 1.1.2 主要仪器设备15-16
• 1.1.3 主要试剂16
• 1.1.4 实验主要试剂的配置16
• 1.2 实验方法16-19
• 1.2.1 牛视网膜毛细血管周细胞原代培养及鉴定16-18
• 1.2.2 周细胞计数18
• 1.2.3 周细胞传代培养18-19
• 1.3 实验结果19-21
• 1.3.1 细胞形态学观察19-20
• 1.3.2 原代牛视网膜微血管周细胞鉴定20-21
• 1.4 小结21-22
• 二、高糖经p38 MAPK调节BRPs P2X7受体及炎症介质表达22-40
• 2.1 对象与材料22-25
• 2.1.1 研究对象22
• 2.1.2 实验主要仪器设备22-23
• 2.1.3 实验主要试剂23
• 2.1.4 实验主要试剂的配置23-25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 实验分组25-26
• 2.2.2 Real-time PCR检测牛BRPs P2X7受体、ICAM-1 及IL-6 的表达26-28
• 2.2.3 Western Blot检测高糖对BRPs P2X7受体表达及其下游p38 MAPK信号通路关键蛋白磷酸化水平的影响28-31
• 2.2.4 统计学方法31-32
• 2.3 实验结果32-39
• 2.3.1 高糖干预后周细胞内P2X7受体的m RNA及蛋白表达量情况32-33
• 2.3.2 高糖状态下激活P2X7受体对炎性因子和粘附分子产生的影响33-34
• 2.3.3 拮抗P2X7受体对高糖培养的BRPs和粘附分子合成的影响34-35
• 2.3.4 高糖干预后周细胞p38 MAPK信号通路关键蛋白磷酸化水平变化35-36
• 2.3.5 拮抗P2X7受体对周细胞p38 MAPK信号通路关键蛋白磷酸化水平的影响36-37
• 2.3.6 阻断p38 MAPK信号通路对P2X7受体表达及炎性因子和粘附分子合成的影响37-39
• 2.4 小结39-40
• 三、讨论40-47
• 3.1 原代牛视网膜微血管周细胞模型的建立40-41
• 3.2 周细胞与糖尿病视网膜病变41
• 3.3 P2X7受体与糖尿病视网膜病变41-42
• 3.4 p38 MAPK信号通路与糖尿病视网膜病变42-43
• 3.5 视网膜微血管周细胞IL-6 及ICAM-1 的产生与糖尿病视网膜病变43-44
• 3.6 P2X7受体与P38 MAPK信号通路44-45
• 3.7 创新点与特色45-46
• 3.8 展望与不足46-47
• 结论47-49
• 参考文献49-56
• 发表论文和参加科研情况说明56-57
• 综述 P2X7受体与糖尿病57-73
• 综述参考文献65-73
• 致谢73-75
• 个人简历75

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本文编号：267666