Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用

发布时间：2020-05-29 21:43

【摘要】：目的:耳蜗螺旋神经节(spiral ganglion neurons,SGNs)能够将毛细胞接收到的声音信号传递至听觉中枢并产生听力,其数量和功能对于维持正常听功能具有重要意义。受限于有限的再生能力,SGNs损伤后很难自发再生并恢复原有功能,各种神经营养因子在此过程中发挥重要作用。神经突起生长因子Neuritin是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子,本课题组前期研究发现其在促进毛细胞转分化再生方面具有重要作用,并可保护神经纤维免于毛细胞缺失所致的继发性损伤,说明其在维持SGNs存活及功能方面具有潜在重要作用。基于上述研究基础,本研究旨在利用长爪沙鼠筛选并建立耳蜗螺旋神经节特异性损伤所致的感音神经性耳聋模型,探究其在保护受损耳蜗SGNs,修复受损听神经功能中的作用,为SGNs缺失导致的感音神经性耳聋的防治提供新的研究策略和科学依据。方法:1、取不同发育时期的耳蜗组织,用qPCR和WB方法,从分子水平检测Neuritin的表达变化;冰冻切片后,用免疫荧光法,检测Neuritin的表达定位,明确Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育各阶段的表达变化。2、选择3种耳毒性药物(卡那霉素和呋塞米联用、新霉素、哇巴因)造模,通过ABR检测和组织形态学分析,筛选并鉴定出长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性损伤的耳聋模型,并探究耳聋发生发展过程中Neuritin的表达变化,明确其表达与该耳聋模型的相关性。3、组织水平,建立乳鼠Corti组织的体外培养体系,使用哇巴因损伤SGNs的同时加入不同浓度的Neuritin蛋白,探究其对受损耳蜗SGNs的保护作用。动物水平,利用方法2中确定的损伤模型,经圆窗滴注不同剂量的Neuritin蛋白,通过ABR检测和组织水平分析,综合评价Neuritin对受损听功能的修复效果。结果:1、检测发现,Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段均有表达,胚胎期第20天(E20)表达量较低,出生后1-56天(P1-56)表达持续升高;其表达主要分布于SGNs和Corti器区域。2、不同药物建模结果显示,仅低浓度哇巴因(1mM)可引起耳蜗SGNs特异性缺失,且伴听力阈值显著上升,最终选定此条件进行损伤模型的建立;进一步研究发现,损伤后耳蜗中Neuritin表达下调,表明Neuritin的表达与该模型具有相关性,且呈负相关。3、体外研究显示,Neuritin(16μg/mL)组和Neuritin(32μg/mL)组每100μm~2 SGNs的数量分别为13.2±1.2和16±2.6,显著高于损伤组的7.3±2.2;每100μm神经纤维的数量分别为8.2±1.1和11.6±1.5,也显著高于损伤组的4.6±1.1,且排列更为整齐;各组毛细胞均不受影响。动物水平结果显示,在哇巴因损伤的同时经圆窗滴注Neuritin蛋白可促进部分听功能的恢复,表现为Neuritin(16μg)组高频区16kHz和32kHz听力阈值分别为32.5±8.9dB,61.3±3.5 dB,显著低于损伤组的48.3±16.0 dB,85±5.5 dB;Neuritin(32μg)组高频区8kHz、16kHz和32kHz听力阈值分别为25±10.7 dB,31.3±9.9 dB,55±5.3dB,均显著低于损伤组。组织形态学检测显示,Neuritin处理组中耳蜗中底回螺旋神经节细胞及神经纤维的数量较损伤组显著增多,与功能检测的结果一致。结论:1、Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育过程中均有表达,尤其在幼年至成年阶段,且主要表达在耳蜗SGNs及Corti区域;2、低浓度哇巴因(1mM)诱导的长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性缺失模型,为本研究选定的最佳动物模型,在该模型中Neuritin的表达与SGNs的损伤呈负相关关系;3、体外和体内研究表明,Neuritin剂量依赖性地维持了受损长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的数量及排列,有效促进了高频损伤区域的听功能恢复。
【图文】：

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图 1 耳蜗螺旋神经节神经连接示意图[6]1.2.3 SGNs 损伤途径的研究关于神经性耳聋的研究一直是热点，其中 SGNs 的损伤是引起神经性耳聋的主要原因。耳锅 I 型 SGNs 是将毛细胞产生的生物电信号传入中枢的第一级传入神经元[7]，其数量占耳锅螺旋神经节神经元总数的绝大部分，因此在 I 型 SGNs损伤的情况下，，可造成不同程度的不可逆的神经性耳聋，这是导致神经性耳聋的重要原因。阐明其损伤的途径，是对其有效治疗或保护的重要基础。据目前研究表明，引起螺旋神经节细胞缺失的途径有很多，主要包括氧化应激途径、离子通道途径、细胞凋亡途径、继发性损伤途径等。主要损伤因素包括耳毒性药物（卡钻、顺销、胆红素、氨基糖苷类抗生素、强心苷类等耳毒性药物）、物理原因（缺血、缺氧、噪声等）、遗传因素、年龄以及感染炎症等。在众多致感音神经性耳聋的因素中，耳毒性药物较为普遍。其中氨基糖苷类

耳蜗,长爪沙鼠

经突起神经生长因子在不同发育阶段长在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段中的表达uritin 与感音神经性耳聋的相关性，本实验首先检发育阶段中的表达变化。取长爪沙鼠不同发育阶.4.4 的蛋白和 RNA 检测方法操作，mRNA 水平沙鼠耳蜗发育的各阶段均有不同程度的表达，且胎期（图 3.1A）。蛋白水平检测结果与 mRNA 示，Neuritin 在胚胎期 20 左右表达量较低，出生 P56 Neuritin 在耳蜗中的表达量持续升高，至出生极显著差异，表明 Neuritin 可能在长爪沙鼠幼年键作用（图 3.1 B）。
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R764

【参考文献】