有氧糖酵解途径对角膜移植免疫排斥反应的影响

发布时间：2020-06-07 20:43

【摘要】：目的:探讨角膜移植免疫排斥过程中有氧糖酵解活性的改变,并进一步评估有氧糖酵解途径对角膜移植免疫排斥反应的影响。方法:(1)随机选取同等数量的三组健康小鼠,建立正常组、同系穿透性角膜移植组、异系穿透性角膜移植组。通过裂隙灯观察小鼠角膜透明度及角膜植片免疫排斥情况,各组小鼠均于角膜移植术后18天左右处死取材,显微镜下分离角膜组织,通过Western Blot及实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)检测各组角膜中有氧糖酵解相关蛋白葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter 1,GLUT1)、6-磷酸果糖-2-激酶(Fructose-2,6-bisphosphatase-3,PFKFB3)、乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDHA)等表达水平的变化;利用乳酸检测试剂盒分析各组角膜中有氧糖酵解终产物乳酸的含量;免疫荧光染色分析有氧糖酵解关键蛋白LDHA以及调控有氧糖酵解关键途径的关键转录因子c-Myc在角膜植片中的表达与分布。(2)随机选取同等数量的三组健康小鼠,建立同系穿透性角膜移植组、异系穿透性角膜移植组、异系穿透性角膜移植联合药物处理组即雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)点眼组。通过裂隙灯观察RAPA对角膜移植免疫排斥反应的影响并记录角膜植片生存时间;在角膜移植术后18天左右处死取材,分离角膜并利用Western Blot分析RAPA对mTOR通路关键转录因子c-Myc以及有氧糖酵解通路相关蛋白表达水平的影响;通过RT-PCR分析各组角膜糖酵解相关基因表达水平变化。(3)随机选取同等数量的两组健康小鼠,建立异系穿透性角膜移植组、异系穿透性角膜移植合并药物治疗组即有氧糖酵解通路关键酶抑制剂3-PO(3-pyridinyl-1-4-pyridinyl-2-propen-1-one)结膜下注射组。在此基础上,通过临床裂隙灯检查角膜植片免疫排斥情况并记录生存时间;角膜移植术后18天左右处死取材,取各组角膜组织进行乳酸含量测定;行RT-PCR检测各组角膜植片中炎性细胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素17(Interleukin-17,IL-17)以及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的表达水平;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析炎性细胞因子IL-1β在各组角膜植片中的含量变化;苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)评估各组角膜植片的病理变化。结果:(1)Western Blot结果显示:与对照组相比,异系角膜移植组有氧糖酵解相关蛋白PFKFB3、LDHA的含量明显增多;RT-PCR结果同样证实:异系角膜移植组有氧糖酵解相关基因PFKFB3、LDHA、GLUT1的mRNA水平较同系角膜移植组明显增加;乳酸定量分析结果表明异系角膜植片中乳酸含量明显升高。以上结果提示,角膜移植免疫排斥过程中有氧糖酵解活性显著增强。免疫荧光染色结果表明有氧糖酵解关键蛋白LDHA在角膜移植免疫排斥反应中明显增高,且多数分布于炎性细胞中;排斥角膜植片中mTOR通路调控的关键转录因子c-Myc表达水平也增高,且同样主要集中于炎性细胞中。以上结果表明角膜移植免疫排斥过程中有氧糖酵解活性明显增强。。(2)经RAPA纳米胶束滴眼液治疗后,角膜植片存活时间明显延长,植片透明度显著增高,且未见明显新生血管长入。Western Blot结果表明,RAPA可有效抑制mTOR通路活性,主要表现为:4E-BP1、S6磷酸化水平明显降低;mTOR信号通路调控的关键转录因子c-Myc表达水平显著减少。经RAPA纳米胶束滴眼液干预治疗后,角膜植片中有氧糖酵解途径关键蛋白PFKFB3、LDHA以及GLUT1等的表达水平明显降低。以上结果提示mTOR/c-Myc可能参与调控角膜移植免疫排斥过程中有氧糖酵通路的活性。(3)与对照组相比,经有氧糖酵解关键酶抑制剂3-PO干预治疗后,角膜植片存活时间明显延长、角膜植片的透明度显著正常、新生血管明显减少。乳酸定量检测结果表明,经3-PO干预后,角膜植片中乳酸的含量明显降低,提示3-PO可有效抑制有氧糖酵解活性。RT-PCR结果显示:经3-PO治疗后,角膜植片中IL-1β、TNF-α以及IL-17A的mRNA水平显著下降。ELASA结果表明:经3-PO治疗后,角膜植片中成熟形式的IL-1β的含量也明显减少。HE染色结果显示注射3-PO组角膜基质中炎性细胞浸润减少。这些结果提示抑制有氧糖酵解途径可有效缓解角膜移植免疫排斥反应。结论:(1)角膜移植免疫排斥过程中有氧糖酵解活性增加。(2)mTOR信号通路可能通过调节关键转录因子c-Myc表达进而调控有氧糖酵解的活性。(3)抑制有氧糖酵解活性可明显缓解角膜移植免疫排斥反应。
【图文】：

图 1.角膜移植免疫排斥中有氧糖酵解通路相关蛋白表达增强。（A）正常、同系、异系角膜移植小鼠术后 18 天眼前节大体相；（B）Western blot 检测三组小鼠有氧糖酵解相关蛋白PFKFB3、LDHA 表达情况；（C）各组小鼠 PFKFB3、LDHA 灰度值的比值情况。28

图 2.角膜移植免疫排斥中有氧糖酵解通路相关基因及终产物表达增强。（A）RT-PCR 检测同系及异系角膜移植组有氧糖酵解相关蛋白 PFKFB3、LDHA、GLUT1 mRNA 表达情况；（B）同系及异系角膜移植组有氧糖酵解终产物乳酸含量的变化；（C）免疫荧光染色显示正常、同系、异系角膜移植角膜免疫细胞及有氧糖酵解通路蛋白 LDHA 分布情况。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R779.65

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本文编号：2701976