细胞自噬维持鼻咽癌CNE2干样细胞干性的初步研究

发布时间：2020-06-20 14:51

【摘要】：目的:研究细胞自噬在维持鼻咽癌CNE2干样细胞干细胞生物特性中的功能,为进一步阐明细胞自噬在调控鼻咽癌发病中的作用提供新的实验依据。方法:1.无血清悬浮培养法从鼻咽癌CNE2细胞系中诱导鼻咽癌CNE2干样细胞(CNE2-SC):1)通过细胞分化实验检测鼻咽癌CNE2细胞与CNE2-SC分化能力;软琼脂克隆形成实验检测CNE2细胞和CNE2-SC克隆形成能力;2)采用流式细胞仪检测鼻咽癌CNE2细胞与CNE2-SC的CD133阳性标记细胞比率;3)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot(WB)检测分析鼻咽癌CNE2细胞与CNE2-SC的干性相关基因及蛋白(Bmi-1,Twist1)表达水平;4)透射电镜实验观察鼻咽癌CNE2细胞与CNE2-SC自噬小体的形成情况;5)实时荧光定量PCR和Western blot检测分析鼻咽癌CNE2细胞与CNE2-SC的自噬相关基因及蛋白(Beclin1,LC3B)表达水平;2.Beclin1-shRNA慢病毒载体的构建和鉴定:1)设计针对Human Beclin1基因的siRNA靶标的三个靶序列和一个对照序列,合成单链DNA oligo片段后,将单链DNA oligo的正义链和反义链混合物制备成双链DNA oligo;2)使用BamH I和EcoR I限制性内切酶对慢病毒质粒pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体进行双酶切后,与制备的双链DNA oligo连接,构成重组质粒,转化感受态细胞,对生成的阳性克隆进行测序验证;3)用pSPAX2、pMD2G和穿梭质粒三质粒系统共转染293T细胞,收集细胞上清液浓缩并测定病毒滴度;4)用构建的Beclin1-shRNA慢病毒感染鼻咽癌CNE2-SC,通过RT-qPCR进行内源性靶筛。3.细胞自噬在鼻咽癌干样细胞中的功能:1)通过软琼脂克隆形成实验检测沉默Beclin1表达对鼻咽癌干样细胞克隆形成的生物学特性的影响;2)再通过RT-qPCR、Western blot实验检测沉默Beclin1后干细胞基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)的表达差异;3)流式细胞术检测分析干细胞标志物CD133的表达情况。结果:1.鼻咽癌CNE2干样细胞可通过无血清悬浮培养法富集,15天后其能稳定传代。1)将CNE2-SC重置于含10%的血清培养基中培养,其能分化为与CNE2细胞相同特性的贴壁细胞;软琼脂克隆形成实验结果表明:CNE2-SC较CNE2的克隆形成率为25±4%vs 8±3%,差异具有统计学意义(P0.05);2)鼻咽癌CNE2-SC(9.6%)CD133阳性标记的细胞比列高于鼻咽癌CNE2细胞(0.3%)(P0.01);3)与鼻咽癌CNE2细胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表达干性相关基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)(P0.01);4)透射电镜观察鼻咽癌CNE2-SC自噬小体较鼻咽癌CNE2细胞形成明显增多;5)与鼻咽癌CNE2细胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表达自噬相关基因和蛋白(Beclin1、LC3B)(P0.01)。2.Beclin1-RNAi慢病毒载体的构建与鉴定:1)经过PCR和测序验证成功构建了重组Beclin1-RNAi慢病毒质粒,并将构建好的shBeclin1序列成功插入载体;2)靶序列1-3及对照序列病毒滴度测定结果分别为3.5×10~8TU/ml、3×10~8TU/ml、2×10~9TU/ml和2×10~9TU/ml;3)Real-time PCR内源性筛靶确定在鼻咽癌CNE2-SC中LV-Beclin1-shRNA1慢病毒对Beclin1基因表达的沉默抑制率最高。3.细胞自噬在鼻咽癌CNE2-SC中的功能:1)构建的shBeclin1慢病毒载体可以有效抑制自噬关键基因Beclin1的表达水平;2)shBeclin1可以抑制鼻咽癌CNE2-SC的克隆形成;3)shBeclin1可以下调Bmi-1、Twist1等干细胞相关基因及蛋白的表达水平;4)shBeclin1可使干样细胞标志物CD133表达降低。结论:1.无血清悬浮培养法能富集鼻咽癌干样细胞;2.鼻咽癌CNE2干样细胞具有干细胞特性及较高水平自噬表达;3.细胞自噬在鼻咽癌干样细胞球中持续激活并以维持鼻咽癌干样细胞干性。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63
【图文】：

干样,鼻咽癌,无血清培养,细胞生长

图 1 无血清培养法富集鼻咽癌干样细胞生长情况(×100)Figure 1 The serum-free culture method enriches the growth of stem-like cells innasopharyngeal carcinoma (×100)注：A 为鼻咽癌 CNE2 细胞，细胞贴壁生长，形态呈椭圆形或不规则形，排列紧密；B 为 CNE2 干样细胞成球悬浮培养第 5天，少数球体开始成形；C 为 CNE2 干样细胞培养第 10 天，可见较大的圆形或卵圆形细胞微球体；D 为 CNE2 干样细胞培养第 15 天，形成由大量细胞紧密结合而成的实体结构。3.2 鼻咽癌干样细胞干细胞特性鉴定3.2.1 细胞分化实验我们对鼻咽癌 CNE2-SC 进行分化潜能的实验检测，将 CNE2-SC 从无血清培养基中转移到 6 孔板中培养，6 孔板内是含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，结果如图 2所示：24 小时后，观察到 CNE2-SC 球体面积减少，单细胞逐渐增多，在第 7 天，悬浮细胞完全消失，在显微镜下观察均为单细胞，并且大多数是贴壁生长。形态与在完全培养基中培养的鼻咽癌 CNE2 细胞无显著差异。

鼻咽癌,干样,显微镜观察,克隆形成

图 2 显微镜观察鼻咽癌 CNE2 干样细胞球分化改变(×100)Figure 2 Phase contrast microscopy observation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 stem-likecell differentiation (×100)注：图中 A 为分化前，细胞呈球形，悬浮生长，细胞间连接紧密；B 为分化后，细胞贴壁生长，呈椭圆形，排列紧密。3.2.2 软琼脂克隆形成克隆形成能力是鼻咽癌干样细胞重要的生物学特性，通过软琼脂克隆形成实验检测鼻咽癌 CNE2-SC 及 CNE2 细胞的自我更新能力，将鼻咽癌 CNE2 及 CNE2-SC 分别消化为单细胞悬液，并将各组细胞铺在加有软琼脂的 6 孔板中培养 2 周，然后拍照计数进行统计分析，结果说明（图 3）：CNE2-SC 的克隆球形成率（25±4%）明显高于CNE2（8±3%）（P＜0.05）。

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