【摘要】：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,近年来发病率显著上升。据估计,2015年世界上有4.15亿成年人(8.8%)患有糖尿病,预计在今后25年内患病率将增加到6.42亿人。我国约有1.14亿糖尿病患者,约占全球糖尿病患者的27%,已成为世界上糖尿病患者最多的国家。糖尿病相关的眼部并发症是成年人失明的主要原因。虽然糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病最主要和最严重的眼部并发症,但是眼部其他组织(如角膜、虹膜、晶状体、视神经)也会出现糖尿病相关的并发症状。以神经纤维进行性丧失为特征的糖尿病神经病变是影响约50%患者的主要并发症。角膜是人体神经支配最密集的组织,其上皮神经密度为皮肤的300~600倍,正常的角膜神经支配是维持角膜敏感性、眨眼反射、眼表稳态、调控角膜伤口愈合的关键因素,其中感觉神经纤维在维持角膜上皮的稳态中起着至关重要的作用。在糖尿病性角膜病变中,由于角膜神经营养因子含量下降,导致感觉神经纤维受损和密度降低,角膜敏感性下降。神经病变是糖尿病性角膜病变的原因之一,其病变的主要表现包括浅表点状角化病和持续性角膜上皮糜烂,上皮性伤口愈合延迟,后者可进展为角膜溃疡,并且对常规临床治疗不敏感。角膜神经含有多种生物活性肽,包括血管活性肠多肽(VIP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)、神经肽Y(NPY)、促生长激素肽(GAL)等,维持着感觉神经正常的生理功能。我们前期已证实了SP、NPY促进糖尿病角膜上皮和神经再生中的作用及其机制。VIP是一种内源性多向性神经肽,通过两种G蛋白偶联受体VIPR1和VIPR2在多种组织器官中发挥生物学效应,其中VIPR1受体具有优先亲和力,是VIP大部分生物学活性的关键受体。VIP在神经系统发育过程中起重要作用,不仅能促进神经元的分化和突起的生长,还能促进神经元的存活和修复。VIP对周围神经系统亦有保护作用,可促进大鼠坐骨神经再生,在皮肤神经源性反应中具有保护性作用。内源性VIP可限制持续的炎症和免疫反应以及促进炎症的消退,维持和调节免疫稳态。目前对VIP的研究虽然广泛,但是尚无其在糖尿病角膜病变中的作用研究,因此本研究的目的是通过体外与体内实验,评价VIP在糖尿病角膜上皮损伤修复、炎症反应及神经再生中的作用,并探讨其作用机制。第一部分目的:通过建立C57BL/6小鼠角膜去神经模型,观察外源性α-CGRP、SP与VIP三种神经肽对小鼠角膜上皮损伤修复及炎症反应的影响。方法:配制树胶脂毒素(Resiniferatoxin,RTX)滴眼液用于C57/BL6小鼠眼表,建立小鼠角膜去神经模型。实验分组:正常(NL)组、RTX组、正常损伤(NW)组、RTX损伤(RTXW)组、RTXW+α-CGRP组、RTXW+SP与RTXW+VIP组。角膜知觉敏感度仪检测NL组与RTX组小鼠角膜知觉敏感度;孟加拉玫红与荧光素钠溶液染色小鼠角膜并照相;全角膜铺片免疫荧光染色(β-tubulin III)检测角膜神经密度。建立小鼠角膜上皮损伤模型:观察NW组、RTXW组、RTXW+α-CGRP组、RTXW+SP与RTXW+VIP组小鼠角膜上皮损伤后愈合速率的差异。RT-PCR检测NL、RTX、NW、RTXW、RTXW+α-CGRP、RTXW+SP与RTXW+VIP组各组间小鼠角膜上皮损伤修复后角膜炎性因子IL1β、IL1RN、CXCL2、IL10、F4/80、NOS2与ARG1的基因水平表达量的差异。结果:成功建立C57BL/6小鼠角膜去神经模型。与正常组相比,RTX组小鼠角膜知觉敏感度显著下降(P0.05);角膜上皮完整性无明显改变(P0.05),角膜神经密度显著下降(P0.05)。通过建立小鼠角膜上皮损伤模型发现:各组小鼠角膜上皮损伤后,与正常组相比,RTX组小鼠角膜上皮损伤后愈合速率显著下降(P0.05);与RTX组相比,RTX+SP组、RTX+α-CGRP组、RTX+VIP小鼠角膜上皮损伤愈合速率显著增加(P0.05)。通过RT-PCR检测正常与RTX小鼠角膜上皮未损伤及损伤后的角膜发现:与NL组相比,RTX组IL1RN、F4/80、NOS2与ARG1表达量均明显增加(P0.05);NW组IL1β、IL1RN、CXCL2、IL10、F4/80、NOS2与ARG1表达量均明显增加(P0.05)。与RTX组相比,RTXW组IL1β、CXCL2、IL10与NOS2表达量均明显增加(P0.05)。与RTXW组相比,RTXW+α-CGRP组IL1β、CXCL2与NOS2明显下降(P0.05);RTXW+SP组CXCL2、IL10与NOS2明显下降(P0.05);RTXW+VIP组IL1β、CXCL2、F4/80与NOS2明显下降(P0.05),IL10明显增加(P0.05)。结论:RTX滴眼液是建立C57/BL6小鼠角膜去神经模型安全、有效的方法。神经肽VIP对小鼠角膜去神经神经后角膜损伤修复速率的促进作用及对炎症反应的抑制作用优于神经肽CGRP与SP。第二部分目的:通过小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2细胞),观察VIP1Ra对正常糖培养TKE2细胞损伤后细胞增殖与迁移的影响及VIP对高糖培养TKE2细胞损伤后细胞增殖与迁移的影响。通过体外培养小鼠骨髓源性巨噬细胞,观察VIP对巨噬细胞的影响。通过体外培养猪角膜,观察重组小鼠音猬因子(rm SHH)对高糖培养猪角膜上皮损伤后愈合的影响。方法:体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞(TKE2细胞)。实验分组:正常组、正常+VIP1Ra组、高糖组及高糖+VIP组。正常糖培养TKE2细胞:检测不同浓度及不同作用时间的VIP对TKE2细胞ERK与SHH信号通路的作用;观察VIP1Ra对TKE2细胞损伤后愈合能力的影响;VIP1Ra对TKE2细胞损伤后ERK与SHH信号通路的作用。高糖环境培养TKE2细胞,进行如下检测:VIP对TKE2细胞损伤后愈合能力的影响;VIP对TKE2细胞损伤后ERK与SHH信号通路的作用。体外培养正常与糖尿病小鼠骨髓源性巨噬细胞。实验分组:正常组、高糖组、正常+VIP组、高糖+VIP组、正常+IL1β组、高糖+IL1β组、正常+IL1β+VIP组、高糖+IL1β+VIP组。观察正常组与高糖组巨噬细胞形态学差异。RT-PCR检测各组细胞IL1β、IL1RN、CXCL2、IL10、NOS2、ARG1的表达量。体外培养猪角膜。实验分组:甘露醇组、甘露醇+SHH受体拮抗剂组(SHH Ra)、高糖组、高糖+rm SHH组。观察rm SHH与SHH Ra对猪角膜上皮损伤后愈合的影响。结果:通过对TKE2细胞的实验研究,结果发现:VIP浓度高于250ng/ml可明显增强TKE2细胞ERK的活化与SHH的表达(P0.05)。VIP对损伤后的TKE2细胞作用1、3、6小时可明显活化ERK及增强SHH的表达(P0.05)。正常糖培养TKE2细胞损伤后,正常+VIP1Ra组TKE2细胞损伤后24小时愈合面积明显低于正常组(P0.05);高糖培养TKE2细胞损伤后,高糖+VIP组TKE2细胞损伤后48小时愈合面积明显高于高糖组(P0.05)。正常+VIP1Ra组TKE2细胞p-ERK与SHH的表达量较正常组明显降低(P0.05);高糖组TKE2细胞p-ERK与SHH的表达量较正常组明显降低(P0.05),高糖+VIP组明显高于高糖组(P0.05)。通过对巨噬细胞的实验研究,结果发现:正常组与高糖组巨噬细胞在形态学上无显著差异。正常+IL1β组与高糖+IL1β组IL1β、CXCL2与NOS2基因水平表达量分别较正常组与高糖组增加;正常+IL1β组IL1RN较正常组升高,IL10与ARG1无明显变化;高糖+IL1β组IL10较正常组升高,IL1RN与ARG1无明显变化。正常+IL1β+VIP组IL1β、CXCL2与NOS2表达量较正常+IL1β组明显下降,ARG1明显增加,IL1RN与IL10无明显变化。高糖+IL1β+VIP组NOS2表达量较正常+IL1β组明显下降,ILRN、IL10与ARG1明显增加,IL1β、CXCL2无明显变化。通过对体外培养猪角膜的实验研究,结果发现:高糖组的猪角膜上皮损伤愈合速度受到显著抑制,rm SHH处理能够抑制高糖对角膜上皮修复的延迟。甘露醇+SHH Ra组猪角膜上皮损伤未愈合面积明显高于甘露醇组;高糖组猪角膜上皮损伤未愈合面积明显高于甘露醇组与高糖+rm SHH组。结论:外源性VIP促进高糖培养条件下小鼠角膜上皮细胞增殖迁移,其作用机制与通过VIPR1受体信号通路增强蛋白水平ERK活化和上调SHH表达相关。VIP可抑制巨噬细胞促炎因子的表达,促进巨噬细胞抗炎因子的表达。rm SHH可通过与受体结合促进高糖环境猪角膜上皮损伤愈合。第三部分目的:通过体内实验(STZ,链脲菌素,诱导I型糖尿病小鼠),观察VIP对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复过程上皮愈合、炎症反应及神经再生的作用,并探讨其作用机制。方法:选取正常C57BL/6小鼠与链脲佐菌素(STZ)诱导的C57BL/6 I型糖尿病小鼠建立小鼠角膜上皮损伤模型,给药方式为结膜下注射。实验分组:正常(NL)组、糖尿病(DM)组、正常损伤(NW)组、糖尿病损伤(DMW)组、正常+VIP(NW+VIP)组、正常+VIP受体拮抗剂(NW+VIP1Ra)组、糖尿病+VIP(DMW+VIP)组、正常+SHH受体拮抗剂(NW+SHH Ra)组、糖尿病+rm SHH(DMW+rm SHH)组与糖尿病+VIP+SHH受体拮抗剂(DMW+VIP+SHH Ra)组。RT-PCR检测NL与DM小鼠角膜上皮及三叉神经节内源性VIP及其受体表达量的差异;Western-blotting及免疫荧光染色检测小鼠角膜上皮VIPR1与VIPR2的表达量。通过小鼠角膜上皮损伤模型的建立,观察NW组、DMW组、NW+VIP组、NW+VIP1Ra组、DMW+VIP组、NW+SHH Ra组、DMW+rm SHH与DMW+VIP+SHH Ra组小鼠角膜上皮损伤后愈合速率的差异及神经再生速率的差异;RT-PCR检测NL组、DM组NW组、DMW组、NW+VIP1Ra组、DMW+VIP组小鼠角膜上皮损伤后角膜神经营养因子基因水平的表达量及炎性因子基因水平表达量;全角膜铺片免疫荧光染色法检测NW组、DMW组、NW+VIP1Ra组及DMW+VIP组中性粒细胞与巨噬细胞在角膜损伤后浸润的差异;Western-bliotting与免疫荧光染色法检测VIP与VIP1Ra分别对糖尿病小鼠与正常小鼠角膜上皮损伤修复过程中p-ERK与SHH蛋白水平的影响。结果:通过对C57/BL6正常与糖尿病小鼠进行的实验研究发现:RT-PCR结果显示:与正常组小鼠相比,糖尿病组小鼠角膜上皮中VIP与VIP受体1(VIPR1)表达量显著下降(P0.05),VIP受体2(VIPR2)无显著差异(P0.05);角膜切片免疫荧光染色结果显示:VIPR1主要表达在角膜缘及周边角膜上皮中,DM组与DMW组小鼠角膜上皮中VIPR1表达量明显低于NL组与NW组。显微镜观察小鼠角膜上皮损伤后修复情况,结果显示:小鼠角膜上皮损伤后,与NW组相比,NW+VIP组角膜修复速率显著增加(P0.05),DMW组、DMW+VIP组、NW+VIP1Ra组与NW+SHH Ra小鼠角膜上皮修复速率显著下降(P0.05);与DMW组相比,DMW+VIP组、DMW+rm SHH组小鼠角膜上皮愈合速率显著增加(P0.05);DMW+VIP+SHH Ra组小鼠角膜上皮愈合速率显著下降(P0.05)。共焦显微镜检查小鼠角膜上皮损伤后神经再生情况,结果显示:与NW组小鼠相比,NW+VIP组角膜神经密度显著增加(P0.05);DMW组、NW+VIP1Ra组与NW+SHH Ra组角膜神经密度显著下降(P0.05),DMW+VIP组无显著差异(P0.05)。与DMW组相比,DMW+VIP组、DMW+rm SHH组角膜神经密度显著增加(P0.05),DMW+VIP+SHH Ra组角膜神经密度显著降低(P0.05)。RT-PCR结果显示:与NL组小鼠相比,NW组角膜NGF与CNTF表达量显著增加(P0.05),DMW组较DM组无明显升高。与NW组相比,DMW组与NW+VIP1Ra组NGF与CNTF表达量均显著下降(P0.05);DMW+VIP组较DMW组相比显著增高(P0.05)。小鼠角膜上皮损伤后,与NW组相比,NW+VIP1Ra组与DMW组角膜中促炎因子IL1β、CXCL2与NOS2等明显增高,抗炎因子IL1RN、IL10与ARG1等显著下降(P0.05);给予VIP治疗后促炎因子显著下降,抗炎因子明显升高(P0.05)。全角膜铺片免疫荧光染色检测结果显示:小鼠角膜上皮损伤后,NW+VIP1Ra组与DMW组角膜中性粒细胞与巨噬细胞浸润数量较NW组显著增加(P0.05);DMW+VIP组角膜中性粒细胞与巨噬细胞浸润数量较DMW组显著减少(P0.05)。Western-blotting检测结果显示:小鼠角膜上皮损伤后P-ERK与SHH蛋白水平表达量显著增加,NW+VIP1Ra组与DMW组较NW组减少(P0.05),DMW+VIP组较DMW组增加(P0.05)。结论:外源性VIP通过其受体VIPR1促进糖尿病小鼠角膜上皮和神经再生,并对糖尿病小鼠上皮损伤后的过度炎症反应具有抑制作用,其作用机制与上调P-ERK、SHH、NGF与CNTF表达量有关。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1
【图文】：
积较正常组显著下降；D：Image J 软件量化角膜神经覆盖面积，正常组：33.49±2.13%。***：P＜0.001经肽 CGRP、SP 与 VIP 对角膜去神经小鼠上皮损伤修复分为正常损伤（NW）组、RTX 损伤（RTXW）组、RTXW+α-CGRP 组、W+VIP 组。各组小鼠角膜上皮刮除后 22 小时，用荧光素钠溶液行角，与正常组相比，RTXW 组小鼠角膜上皮愈合率显著降低（P-CGRP 组显著降低（P＜0.05），RTXW+SP 与 RTXW+VIP 组无明显 RTXW 组相比，给予神经肽治疗的 RTXW+α-CGRP、RTX+SP 与 R增加（P＜0.05）；在神经肽治疗组中，RTXW+VIP 组较 RTXW+α-C皮愈合率明显增加（P＜0.05）。如图 2 所示济南大学博士学位论文
14图 3. 神经肽 CGRP、SP 与 VIP 对 RTX 小鼠角膜上皮损伤后的炎性因子的影响。RT-PCR 检测发现： RTX 未损伤组 IL1RN、F4/80、NOS2 与 ARG1 表达量均高于正常组；正常损伤组 IL1β、IL1RN、CXCL2、IL10、F4/80、NOS2 与 ARG1 表达量均高于正常组。RTXW 组 IL1β、CXCL2、IL10 与 NOS2 表达量均高于 RTX 未损伤组。RTXW+α-CGRP 组 IL1β、CXCL2 与 NOS2表达量低于 RTXW 组；RTXW+SP 组 CXCL2、IL10 与 NOS2 表达量低于 RTXW 组；RTXW+VIP 组IL1β、CXCL2、F4/80 与 NOS2 表达量低于 RTXW 组，而 IL10 表达量高于 RTXW 组。NS：无统计学差异；*： P＜0.05； **：P＜0.01；***：P＜0.001
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本文编号：2734476
