基于高通量测序技术的真菌性角膜炎模型转录组学研究

发布时间：2020-07-07 14:05

【摘要】：真菌性角膜炎是全球发病率较高的致盲性眼病,而由于不同的菌种对抗真菌药物的敏感性问题,至今没有一种特别有效的根治该疾病的疗治疗方法和手段。动物机体本身对真菌感染存在着固有的免疫性应答机制,以此来快速有效地识别病原体并抵抗病原入侵。不同细胞群体上存在着各种模式识别受体(PRRs)如C型凝集素受体(CTLRs)、Toll样受体(TLRs)、RIG-1样受体和含有Nod蛋白的核苷酸结合寡聚化结构域(NLRs),它们可以识别真菌入侵者并触发信号传导途径和细胞反应来消灭病原体。然而,以往的研究大多数是针对单个的受体因子来开展相关的探索,缺乏较为系统的真菌性角膜炎发病机理的遗传因素解析。因此,本课题基于构建好的真菌性角膜炎模型,并利用高通量测序技术获取相关样本的转录组数据信息,通过大数据统计学分析筛选小鼠真菌性角膜炎发病过程中显著性参与的差异表达基因集、信号通路以及关键因子的表达调控网络。具体实验内容如下:其一,我们成功地构建了烟曲霉菌感染角膜组织的C57BL/6小鼠模型。38只小鼠均适应性饲养1周,随机分为3组:1)空白组:5只小鼠的角膜不予任何干预;2)对照组(PBS组):15只小鼠均在右眼角膜基质内注射磷酸盐缓冲液(PBS),左眼不予任何处理;3)实验组(S组):18只小鼠均在右眼角膜基质内注射孢子悬液,左眼不予任何处理。所有实验小鼠连续培养5天。其二,分别选取PBS组实验小鼠角膜为对照组样本PBS1,实验组培养第2天小鼠角膜样本为S2,实验组培养第5天小鼠角膜样本为S5作为实验样本,通过RNA抽提、纯化、建库之后,采用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)基于Illumina HiSeq X10测序平台,对这些文库进行双末端(Paired-end,PE)测序。其三,对测序样本和测序数据进行严格的质量控制,获取了每组样本6G clean data的高通量测序数据,并且三组样本的测序数据Q20水平均达到95%以上,Q30水平均达到90%以上,基于主成分分析和样品相关性检验显示三组测序样本存在着明显的异质性,数据质量满足后续转录组分析的要求。其四,通过对PBS1组和S2组的基因表达谱数据进行比较(S2组/PBS1组),并基于阈值标准即|log2FoldChange|1以及显著性P-value0.05,我们筛选出了显著性差异表达基因总数为646个,包括上调基因455个和下调基因191个,如上调基因Spdef和下调基因Galnt15;通过对S5组和S2组的基因表达谱数据进行比较(S5组/S2组),我们筛选出了显著性差异表达基因总数为739个,包括上调基因650个和下调基因89个,如上调基因Marco和下调基因Ccl4。不同时间点显著性差异表达基因集比较结果显示,在S2组/PBS组和S5组/S2组这两种比较中均表现为下调的基因数为3个,包括Gldc、Aldh1a1和Ppp1r3c基因;在两种比较中均表现为上调的基因数为49个,包括Casp12和Il1r2基因等。有意思的是,在S2组/PB组比较中表现为上调但在S5组/S2组比较中表现为下调的基因数为33个,包括Il1b基因等;在S2组/PBS组比较中表现为下调但在S5组/S2组比较中表现为上调的基因数为93个,包括Wnt5a基因等。大部分筛选的基因在以往的真菌性眼病或免疫学研究中有报道。其五,基于基因集富集分析方法,我们鉴定出了小鼠真菌性角膜炎发病过程的与信号转导(Signal Transduction)类别相关的信号通路。其中S2/PBS过程显著性富集的信号转导相关通路包括TNF信号通路(FDR=2.32E-11)、NF-kappa B信号通路(FDR=2.66E-05)、PI3K-Akt信号通路(FDR=3.86E-05)、JAK-STAT信号通路(FDR=7.70E-05)、MAPK信号通路(FDR=2.03E-03)、Rap1信号通路(FDR=1.46E-02)和HIF-1信号通路(FDR=3.54E-02)。与之相比,Wnt信号通路(FDR=3.62E-02)、cGMP-PKG信号通路(FDR=4.10E-02)和Hippo信号通路(FDR=4.27E-02)特有地富集于真菌感染小鼠角膜的第五天。另外,我们基于白细胞介素-1β基因Il1b作为真菌性角膜炎小鼠基因表达调控的关键靶基因位点构建了Card9-Casp1-Il1b调控网络用以解析小鼠真菌性角膜炎的发病机理,并针对C型凝集素受体信号通路基因(特别是Card9基因和炎症细胞因子)在真菌性角膜炎模型中的表达模式进行了探究。通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)实验结果均显示,Card9基因在三组样本即PBS1组、S2组和S5组中的表达量均较低,三组比较言之,在真菌感染的第二天Card9基因表达量呈现上升趋势,而在真菌感染的第五天Card9基因表达量呈现一定的下降趋势。综上所述,基于高通量测序技术的真菌性角膜炎模型的转录组学研究为系统性解析真菌性角膜炎发病机理提供了一定的理论基础和数据支撑,并可为其药物治疗提供更多的靶位点,如Card9。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R772.21

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