间充质干细胞来源的外泌体对视网膜脱离的治疗作用

发布时间：2020-07-16 01:47

【摘要】：目的光感受器细胞的变性和坏死是各种视网膜疾病视力下降的最终环节,包括视网膜脱离(retinal detachment,RD)。视网膜脱离后可发生一系列的病理变化,包括胶质细胞增生、炎症反应和色素上皮细胞的增殖等。光感受器细胞的死亡机制复杂,包括自噬、凋亡、坏死和炎症反应等各种病理机制,并交错影响。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有神经保护、免疫调节、抑制炎症和促进组织修复等功能。已有研究表明MSCs不是通过直接诱导分化而是以旁分泌的方式发挥治疗作用。间充质干细胞来源的外泌体(exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-exos)通过传递蛋白质和RNA完成细胞间的通讯,可介导MSCs的多项生物学功能,已在多种动物模型中得到验证。本实验应用大鼠视网膜脱离模型,观察间充质干细胞来源的外泌体对视网膜脱离是否具有治疗效果,并初步探讨MSC-exos发挥治疗作用的机制,为MSC-exos在变性类眼部疾病中的临床应用奠定一定的基础。方法1.培养原代间充质干细胞:体外培养Sprague—Dawley(SD)大鼠骨髓干细胞来源的MSCs,传代扩增。2.收集并鉴定间充质干细胞来源的外泌体:收集第3代至第5代培养MSCs的细胞上清液,超速离心后用大约200ul容积的磷酸盐缓冲液重悬沉淀,分别用电镜观察法和免疫印迹分析法鉴定MSC-exos,最后用BCA蛋白定量试剂盒测量浓度后分装储存于-80oC冰箱中待用。3.大鼠视网膜脱离模型的建立:随机将SD雄性大鼠分为正常组、对照组、PBS治疗组和MSC-exos治疗组,每组≥3只。视网膜下注射透明质酸钠建立视网膜脱离模型,并原位注射不同浓度的5ul MSC-exos或者5ul PBS。4.测定肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1(Interleukin 1 beta,1L-1β)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)的m RNA表达水平,并确定MSC-exos最合适的治疗浓度。5.免疫蛋白印迹法测定炎症因子TNF-α和1L-1β,自噬标志物微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3)和自噬基因Atg5的蛋白表达水平。6.苏木素-伊红(HE)染色观察视网膜组织病理变化:于造模后第7天处死各组大鼠并摘除眼球,Image J软件测量外核层的厚度。7.原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测光感受器细胞凋亡:造模后第3天处死各组大鼠并摘除眼球,连续冰冻切片,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡,Image J软件进行凋亡细胞计数。8.蛋白质谱分析来源于大鼠的MSC-exos,检测外泌体中蛋白质的种类和功能。结果1.用不含外泌体的血清成功培养原代大鼠骨髓干细胞来源的MSCs,收集3至5代的上清液,经典的超速离心法从上清液中提取外泌体,免疫蛋白印迹法证明有CD9和CD81的表达,电镜观察到盘状纳米级囊泡。2.成功建立大鼠视网膜脱离模型。3.QRT-PCR显示造模后第3天MCP-1、TNF-α、1L-1β和IL-6的m RNA表达水平均有增高,相比较于PBS治疗组,MSC-exos治疗组的TNF-α和1L-1β表达水平均有明显下降,差异有统计学意义(P0.05),并选定MSC-exos的最佳治疗浓度为0.1mg/ml。4.免疫蛋白印迹法结果与QRT-PCR结果一致,相比较PBS治疗组,MSC-exos治疗显著减少炎症因子TNF-α和1L-1β的表达,并且增加了自噬标志物LC3-II/LC3-I和Atg5的表达水平。5.TUNEL法显示造模后第3天,网脱部位出现大量凋亡细胞,相比较于PBS治疗组,MSC-exos治疗组的细胞阳性凋亡数明显减少,组间有统计学差异(P0.05)。6.HE染色显示造模后第7天,各组视网膜的组织结构均紊乱且厚度变薄。MSC-exos能维持视网膜结构的稳定,减少外核层的丢失。7.蛋白质谱分析显示MSC-Exos内含有具有抗炎、抗凋亡和神经保护作用的蛋白质。结论MSC-exos能减轻大鼠视网膜脱离后的炎症反应,增强自噬,减少光感受器细胞的凋亡,保护视网膜组织结构。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.12
【图文】：

扫描电镜显示有很多直径40 100nm之间双层脂质结构的类圆形小囊泡，即外泌体。Western blot也证实MSC-exos具有外泌体的标志，CD81和CD9。图1 图中可见很多类圆形小囊泡，直径位于40-100nm之间，表面标志蛋白CD81和CD9均有表达。2.2 MSC-Exos减轻网脱后的炎症反应研究显示在网脱后第三天光感受器细胞死亡到达高峰期，炎症因子水平显著增高。MCP-1、TNF-α、1L-1β和IL-6在光感受器变性过程中起到重要作用。我们首先用PCR检测不同浓度的MSC-Exo治疗网脱的结果。PCR结果显示在网脱后第3天，4种炎症因子水平均有显著增高，相对于PBS治疗组而言，MSC-Exo明显减少了TNF-α和1L-1β的表达，分别减少了63%和75%

10 xos对炎症因子表达水平的影响。（A）PCR结果显示网脱后F-α 和1L-1β均升高，MSC-Exos减少了TNF-α 和1L-1β的t 显示网脱后第 3 天 TNF-α 和 1L-1β 水平升高，MSC-Exo表达。（N 组为正常组，C 组为视网膜脱离对照组，P 组 MSC-Exos 治疗组，N≥3 只 P<0.05）os能维持视网膜组织结构的稳定性和减少光感受器细胞器细胞的丢失是造成网脱患者视力丧失最主要的原因。有器死亡的主要形式，网脱后12小时就可以发现光感受器高峰。我们利用HE组织染色和TUNEL凋亡染色观察MS微镜下显示正常组大鼠视网膜各层组织结构清晰，细胞排脱后第7天，视网膜组织结构紊乱，外核层变薄。HE病理和内核层的厚度。相比较PBS治疗组，MSC-Exo治疗组

SC-Exos治疗后视网膜结构及细胞凋亡的变化。(A)网脱后脱离组、PBS治疗组和MSC-Exos治疗组的视网膜HE染色组，MSC-Exo治疗组的ONL/INL比值水平明显提高。(B)量增多，相比较PBS治疗组而言，MSC-Exos治疗组TUNE*P<0.05，n=3组)。xos增加了光感受器细胞的自噬受器细胞面对外界各种压力时可激活自噬反应。虽然自噬介导细胞的死亡，但是研究表明在大多数情况下自噬能保用免疫蛋白印迹法检测了自噬标志性因子 LC3 和 Atg5。rn Blot 结果显示相比较 PBS 治疗组，MSC-Exo 治疗组 LC39%的提升，并且明显减少了 Atg5 的裂解，证明 MSC-Ex

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本文编号：2757325