慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因对661W细胞光损伤抗凋亡能力影响的实验研究

发布时间：2020-07-28 18:38

【摘要】：目的:将慢病毒介导的CREG基因转染至661W细胞,通过观察过表达CREG基因修饰的661W细胞在光损伤条件下的抗凋亡能力,评价CREG基因对光感受器细胞光损伤时的保护作用,探讨其作用机制。方法:1、培养细胞,对661W细胞株和293T细胞株进行复苏后传代培养、冻存并计数。2、构建慢病毒介导的CREG基因表达载体。3、转染661W细胞,Western blot验证慢病毒介导的CREG基因转染661W细胞的表达;获得慢病毒介导CREG基因稳定转染的~(CREG)661W细胞和GFP空载体对照~(GFP)661W细胞。4、制备~(CREG)661W细胞和~(GFP)661W细胞光损伤模型并将正常的661W细胞(~(Normal)661W)设为正常空白组。5、Hoechst/PI染色法检测各组细胞形态学的改变情况,观察各组细胞形态学上的差异;BCA法测定各组细胞蛋白浓度,蛋白质免疫印迹法检测各组细胞中不同凋亡相关蛋白Caspase3/8/9、Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。6、应用P38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及ERK抑制剂PD98059预处理各组细胞,Western blot检测光损伤后MAPK凋亡信号通路中关键蛋白P38、JNK、ERK及它们的磷酸化形式的表达量,对蛋白条带灰度值统计和定量分析,从而对CREG基因修饰的661W细胞是否对光损伤诱导的细胞凋亡有抑制作用及其作用机制进行评估。结果:1、pLvx-puro-CREG质粒成功转染至293T病毒包装细胞中且转染效率大于70%。2、慢病毒成功感染至661W细胞中,嘌呤霉素重复筛选后建立稳定的~(CREG)661W细胞系。3、CREG蛋白的Western印迹分析证实了慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子(CREG)基因感染的成功。4、细胞形态学检测分析LD~(CREG)661W与其他组LD~(Normal)661W和LD~(GFP)661W相比较,细胞凋亡明显减少(P0.05)。5、Western blot检测实验各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平,光损伤实验组Caspase3/8/9及Bax的蛋白表达量均低于光损伤对照组(P0.01),而光损伤实验组Bcl-2的蛋白表达量显著高于光损伤对照组(P0.01)。6、Western blot检测抑制剂预处理~(CREG)661W细胞显示JNK、P38、ERK磷酸化与非磷酸化蛋白比值表达量较对照组有不同程度的降低,p-JNK/JNK及p-P38/P38相比差异较显著,p-ERK/ERK相比次之(P0.05)。结论:1、通过慢病毒介导的CREG基因转染661W细胞可获得稳定转染的~(CREG)661W细胞系。2、携带CREG基因的视网膜光感受器样细胞(~(CREG)661W细胞)抑制光损伤凋亡能力明显增强。3、MAPK信号通路中的JNK及P38是抑制视网膜光损伤感光细胞凋亡的关键信号通路。
【学位授予单位】：内蒙古民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.1
【图文】：

转染pLvx-puro-CREG的293T细胞发出绿色荧光

感染CREG基因24h后的661W细胞发出绿色荧光

感染CREG基因重复筛选后的661W细胞发出绿色荧光

【参考文献】

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本文编号：2773287