【摘要】：研究目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)是最常见的两种慢性呼吸系统性疾病,两病共存称为呼吸重叠综合征(OS)。由于OSA和COPD两种疾病均可引起体内氧化及抗氧化失衡和白细胞的激活以及功能紊乱,所以容易诱发全身系统性的炎症反应,增高体内炎症因子水平,促进重叠综合征病情进展和加重。从病理生理过程来看,OSA与COPD患者均会出现低氧血症。OSA和COPD两类患者的缺氧特征分别表现为夜间睡眠期间的间歇性缺氧与持续慢性缺氧。因缺氧导致的全身炎症反应,致使与之有关的炎症因子呈级联放大瀑布式反应,从而引起相关并发症,比如肺动脉高压、动脉粥样硬化、心血管疾病等。COPD和OSA都是心血管疾病的独立危险因素,可见在OSA与COPD两病共存的情况下,其有更高的心血管疾病合并症风险,死亡率更高,预后更差。目前对重叠综合征及其合并症的研究主要集中于临床和流行病学方面,其它方面的研究还很少,尤其在细胞学方面的研究。本课题探索性地提出从细胞水平研究重叠(间歇伴持续)模式低氧暴露下血管内皮细胞和中性粒细胞共培养血管内皮细胞的损伤机制,血管内皮细胞和中性粒细胞交互作用机制及抗氧化剂Tempol和炎症通道的阻断剂PTDC进行干预后对血管内皮细胞的保护作用,以期为揭示重叠综合征患者并发心血管疾病的可能发病机制与可行干预措施提供必要理论和实验依据。研究内容:1、从细胞水平研究间歇伴持续低氧暴露下中性粒细胞与内皮细胞共培养对血管内皮细胞损伤机制及各机制间相关性分析。2、细胞交互作用在重叠(间歇伴持续)低氧暴露所致血管内皮细胞损伤中的重要性及细胞间黏附分子-1的作用研究。3、从细胞水平探究抗氧化剂Tempol和炎症通道的阻断剂PTDC对间歇伴持续低氧暴露所致血管内皮细胞损伤的保护作用。研究方法:第一部分:从健康志愿者抽取空腹外周静脉血,应用双层密度梯度离心法分离中性粒细胞,然后将中性粒细胞与制备好的人脐静脉内皮细胞共培养4小时,后应用呼吸仿真系统(天津医科大学总医院呼吸与危重症学科)进行不同低氧模式(N、IH、CH、OS)的分组暴露,时间分为2小时、5小时、8小时,各组分别留取中性粒细胞与血管内皮细胞共培养上清液、血管内皮细胞。共进行10次试验即n=10。通过ELISA法检测上清液的炎症因子IL-6,TNF-α及粘附分子ICAM-1。化学试剂法检测CAT活性、MDA浓度。实时荧光定量PCR技术检测内皮细胞促凋亡基因Bak和抗凋亡基因Bcl-xl mRNA表达水平。第二部分:将中性粒细胞与内皮细胞直接共培养的OS组与单纯内皮细胞培养的OS(H)组同时置于细胞培养箱内培养4小时,然后应用天津医科大学总医院呼吸科呼吸仿真系统进行间歇伴持续低氧暴露8小时,暴露后分别收集上清液和内皮细胞。检测指标(同第一部分)。第三部分:将提取的中性粒细胞与内皮细胞共培养后,一组进行常氧暴露设为N组,其余三组均进行间歇伴持续低氧暴露,不加入任何试剂的设为OS组,加入Tempol的设为(OS+T)组,加入PTDC的设为(OS+P)组,每组分别进行2小时、5小时、8小时低氧暴露。暴露后分别收集上清液和内皮细胞。检测指标(同第一部分)。研究结果:第一部分:1、上清液炎症因子、粘附分子、氧化应激各指标比较:结果显示2h、5h、8h低氧暴露各组趋势相同且具有时间依赖性:所检测各指标各组与N组比较均有统计学差异(P0.05);TNF-a、IL-6、ICAM-1、MDA水平OS组高于IH组、CH组,CAT活力值OS组低于IH组、CH组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。2、内皮细胞凋亡基因表达水平比较:结果显示2h、5h、8h低氧暴露各组趋势相同:各指标各组与N组比较均有统计学差异(P0.05);OS组Bcl-x1、Bcl-x1/BAK表达水平低于IH组、CH组,BAK表达水平高于IH组、CH组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);随着低氧暴露时间的延长,促凋亡基因及抑凋亡基因表达水平均表现出增加趋势,而Bcl-x1/BAK水平呈下降趋势,提示促凋亡基因起主要作用。3、炎症因子、氧化应激指标、凋亡基因的相关性分析:炎症因子IL-6和TNF-α与抗氧化指标CAT呈较强负相关,与氧化应激指标MDA呈较强正相关,P0.05;炎症因子IL-6和TNF-α与凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈较强负相关,P0.05;抗氧化指标CAT与凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈较强正相关,氧化应激指标MDA与凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈较强负相关,P0.05。第二部分:1、OS(H)组与OS组各指标比较:OS(H)组IL-6、TNF-α、ICAM-1、MDA、BAKmRNA表达水平、Bcl-xl mRNA表达水平均低于OS组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05),OS(H)组CAT的活力值、Bcl-xl/BAK比值均高于OS组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。2、ICAM-1与各变量相关性分析:ICAM-1与IL-6、TNF-α、MDA呈较强的正相关;与CAT、Bcl-xl/BAK呈较强的负相关,P0.05。第三部分:1、上清液炎症因子、粘附分子及氧化应激指标比较:结果显示2h、5h、8h低氧暴露各组趋势相同:TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA水平OS组高于N组、OS+T组、OS+P组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);OS+T组及OS+P组高于N组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);OS+T组与OS+P组比较差异无统计学意义;且随着暴露时间的逐渐延长,TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA浓度有升高趋势。CAT活力值OS组低于N组、OS+T组、OS+P组,OS+T组及OS+P组低于N组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);OS+T组与OS+P组比较差异无统计学意义;但随着低氧暴露时间的延长,CAT有下降趋势。2、内皮细胞凋亡基因表达水平比较:结果显示2h、5h、8h低氧暴露各组趋势相同:OS组抑凋亡基因Bcl-x1表达水平及Bcl-x1/BAK比值低于N组、OS+T组、OS+P组,促凋亡基因BAK表达水平高于N组、OS+T组、OS+P组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);OS+T组及OS+P组抑凋亡基因Bcl-x1表达水平及Bcl-x1/BAK比值低于N组,OS+T组及OS+P组促凋亡基因BAK表达水平高于N组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05);OS+T组与OS+P组比较差异无统计学意义。随着低氧暴露时间的延长,促凋亡基因及抑凋亡基因表达水平均表现出增加趋势;而Bcl-x1/BAK水平呈下降趋势。研究结论:根据本课题研究可以得出如下结论:1、中性粒细胞与血管内皮细胞共培养后间歇伴持续低氧暴露模式与常氧模式、间歇低氧模式、持续低氧模式相比炎症反应及氧化应激更剧烈、内皮细胞凋亡加速更明显,内皮损伤更严重。提示炎症反应、氧化应激、及凋亡基因共同参与了重叠低氧暴露所致血管内皮细胞受损。2、重叠低氧暴露模式所致血管内皮细胞损伤具有时间依赖性,随着作用持续时间的增加,所致血管内皮细胞的损伤也在逐渐加重。3、氧化应激、炎症、及内皮细胞凋亡基因均参与了重叠低氧模式所致血管内皮细胞损伤,三者之间两两存在强相关性。互相促进,循环往复,使血管内皮细胞损伤呈级联放大瀑布式加重。4、重叠低氧状态下中性粒细胞与血管内皮细胞的交互作用使内皮细胞损伤相关的炎症、氧化应激及内皮细胞凋亡更加剧烈。即中性粒细胞与内皮细胞间的交互作用促使重叠低氧模式暴露下所致血管内皮细胞损伤更严重,5、黏附分子ICAM-1与炎症因子、氧化/抗氧化指标及凋亡基因均存在强相关性,在内皮细胞损伤机制中起了重要作用。6、重叠低氧暴露模式所致血管内皮细胞炎症因子及黏附分子增加,氧化应激增强及内皮细胞凋亡加速均可被抗炎及抗氧化剂部分抑制。抗炎及抗氧化干预可以起到保护血管内皮细胞的作用。具有治疗重叠综合征并发心血管疾病的潜力。7、抗炎及抗氧化治疗早期应用即产生效果,提倡早干预,早治疗。可以避免产生不良后果,导致多脏器功能受损。8、抗炎及抗氧化干预仅可部分保护血管内皮细胞,仍不能完全逆转内皮细胞损伤,考虑与内皮细胞损伤机制的多分子通道途径有关。期待更进一步的研究能够通过多靶点精准治疗完全逆转内皮细胞损伤。9、低氧导致炎症与氧化应激具有强的相关性,试剂Tempol及PDTC都具有清除氧自由基ROS的抗氧化作用及抑制炎症通道NF-κB的抗炎作用,两种试剂的抗炎及抗氧化作用无明显差异。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R766;R563.9
【图文】：
图 1：COPD 和 OSA 在易患心血管疾病的炎症机制中的相互作用。 除肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-8（IL-8）外，COPD 和 OSA 均与 C 反应蛋白（CRP）和白细胞介素-6（IL-6）水平升高有关， 并且还与氧化应激有关。 然而，吸烟和肥胖是这些关联中的混淆变量。 缺氧是 OSA 中 TNF-α产生升高的关键因素，这与重叠综合征特别相关。 每种炎症途径都与动脉粥样硬化和随后的心血管疾病有关。
课题总技术路线图
图 1.1 不同低氧暴露各组不同时段 TNF-a 浓度比较表 1.2 不同低氧暴露各组不同时段 IL-6 浓度比较（pg/ml n=10 x±S）组别 2h 5h 8hN 7.22±2.85c7.58±2.36c8.04±2.82dIH 34.70±8.83b46.59±19.32b107.30±28.79b*#CH 27.74±8.26b36.46±10.22b79.42±30.32c*#OS 53.09±20.05a67.46±13.17a*148.94±24.26a*#F 25.823 37.764 59.905P 0.000 0.000 0.000同列标注不同字母(a>b>c>d)P＜0.05，与 2h 比较，*P＜0.05；与 5h 比较，#P＜0.05。
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