KRT8磷酸化介导自噬调控视网膜色素上皮细胞间质化在增生性玻璃体视网膜病变中的机制研究

发布时间：2020-08-09 16:42

【摘要】：背景:增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一种严重的致盲性眼科并发症,常继发于孔源性视网膜脱离和眼球穿通伤等。同时,PVR也是视网膜脱离手术失败的最常见原因。其中,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞发生的上皮—间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是PVR发生发展的关键机制。在此过程中,RPE细胞的极性和细胞间连接消失,逐渐转变为成纤维样细胞并表达细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白,参与视网膜表面纤维膜组织的形成。由于EMT潜在的分子机制尚不清楚,临床上对于PVR缺少有效的预防和治疗手段。因此,探讨并阐明RPE细胞在EMT过程中的关键分子机制和调控因素,具有重要的意义。自噬(autophagy)是一种高度保守的,经溶酶体途径降解细胞内大分子和受损细胞器的过程,对于维持RPE细胞内环境的稳定具有重要作用。同时,自噬水平的异常变化与RPE细胞多种病理性改变有关。近年来,在多个组织和器官的纤维化过程中均观察到自噬水平的变化,其在EMT中的调控作用也逐渐受到关注。然而,在RPE细胞中,自噬与EMT的关系及其调控机制尚不清楚。角蛋白(keratin,KRT)8是上皮细胞中含量最多的中间丝蛋白,也是成熟RPE细胞的标志物。最近研究发现,KRT8不仅具有维持细胞形态等骨架蛋白的功能,而且通过多种翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)方式,特别是磷酸化修饰,参与细胞生长、细胞迁移和细胞应激等多种细胞活动。目前,尚无KRT8及其磷酸化对于RPE细胞EMT过程影响的研究报道,其与自噬之间的相互作用机制也有待进一步研究。本研究旨在探究自噬与KRT8磷酸化在RPE细胞EMT过程中的调控作用,以及两者间可能存在的相互作用关系,为完善PVR的发病机制,以及临床预防和治疗PVR奠定基础。方法:1、利用10ng/ml TGF-β2处理人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19),相差显微镜观察细胞形态变化,western-blot检测EMT标志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ的表达水平。在此模型基础上,westem-blot检测自噬标志性蛋白LC3-II、Atg5-12、Beclin 1和p62的表达水平,共聚焦显微镜观察GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3的荧光水平。同时,利用自噬抑制剂Baf-A1预处理ARPE-19细胞,TGF-β2刺激后western-blot检测LC3-Ⅱ表达水平的变化。此外,在TGF-β2刺激前加入自噬抑制剂(3-MA和Baf-A1)或转染特异性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)对ARPE-19细胞预处理,细胞划痕实验和western-blot分别检测细胞迁移能力和EMT标志性蛋白表达水平的变化。2、在体外ARPE-19细胞EMT模型的基础上,westem-blot检测KRT8和p-KRT8表达水平,并在TGF-β2刺激前转染si-KRT8,western-blot检测EMT标志性蛋白表达水平。同时,分别对ARPE-19细胞自噬(3-MA、Baf-A1和si-ATG5)和KRT8及其磷酸化(si-KRT8)水平进行干预,TGF-β2刺激后westem-blot检测自噬标志性蛋白(LC3-Ⅱ和p62)、KRT8和p-KRT8的表达水平变化,并利用细胞免疫荧光进一步检测细胞中p-KRT8的表达水平。最后,TGF-β2刺激前ARPE-19细胞分别转染KRT8表达质粒(KRT8-WT)和磷酸化失活质粒(KRT8-S74A),westem-blot检测自噬标志性蛋白表达水平,共聚焦显微镜观察mRFP-GFP-LC3荧光水平,细胞免疫荧光检测LC3B和LAMP2在细胞内的共定位情况。3、收集临床上PVR患者的视网膜增殖膜样本,免疫荧光技术检测其中KRT8和自噬标志性蛋白LC3B的表达情况。结果:1、TGF-β2可以诱导ARPE-19细胞表达EMT标志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ,并且细胞形态出现纤维化样改变。同时,TGF-β2促使自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、Atg5-12和Beclin 1表达增加,p62降解增加,细胞内GFP-LC3荧光斑点增多;Baf-A1预处理可以进一步增加LC3-Ⅱ表达,且mRFP-GFP-LC3中黄色和红色荧光斑点增多。另外,预先加入自噬抑制剂(3-MA和Baf-A1)或转染特异性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)干扰ARPE-19细胞自噬活性,明显抑制TGF-β2诱导的细胞迁移能力增强和EMT标志性蛋白表达增多。2、TGF-β2可以促进ARPE-19细胞中p-KRT8表达增加,而不影响KRT8表达水平。同时,转染si-KRT8可以抑制TGF-β2诱导的ARPE-19细胞EMT标志性蛋白表达增多。在TGF-β2刺激前,加入3-MA或转染si-ATG5阻断自噬起始阶段,可以使ARPE-19细胞中p-KRT8表达减少,而加入Baf-A1阻断自噬后期阶段则进一步增加p-KRT8表达水平;转染si-KRT8可以使LC3-Ⅱ表达增加,而p62降解减少。另外,相比KRT8-WT,转染KRT8-S74A的ARPE-19细胞在TGF-β2刺激后LC3-Ⅱ表达增加,而p62降解减少,并且mRFP-GFP-LC3中黄色荧光斑点增多,LC3B和LAMP2共定位减少。3、免疫荧光结果显示,视网膜增殖膜组织中KRT8和LC3B均有较高水平表达,并且两者存在明显的共定位。结论:1、TGF-β2可以同时诱导ARPE-19细胞发生EMT和自噬,调控自噬可以有效逆转其EMT过程。2、TGF-β2可以促进ARPE-19细胞中KRT8的磷酸化,且KRT8磷酸化通过影响自噬过程中自噬小体—溶酶体的融合,间接参与调控EMT过程。3、在PVR患者视网膜增殖膜组织中KRT8和LC3B高表达且存在共定位,与体外实验结果一致。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.1
【图文】：

表达水平,细胞,细胞形态,蛋白

逦１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋细胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，提取细胞全逡逑蛋白进行ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，结果显示ＥＭＴ标志性蛋白ａ－ＳＭＡ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和逡逑ｃｏｌｌａｇｅｎｌＶ的表徶水平逐渐增加（图１．１）。同时，ＡＲＰＥ－１９细胞在１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－ｐ２逡逑下分别作用２４ｈ和４８ｈ，倒置相差显微镜观察细胞形态，发现刺激后细胞形态出现逡逑纤维化样的改变，细胞变为长梭形，细胞间排列紊乱且松散（图１．２）。上述结果逡逑表明，ＴＧＦ－Ｐ２可以诱导ＡＲＰＥ－１９细胞发生ＥＭＴ。逡逑ＴＧＦ－ｐ２逡逑Ｔｉｍｅ逦逦逡逑（ｈｒｓ）邋0邋２逦６逦１２逦２４逡逑＾ｍｍｒｎ逦ＶＮＰ邋ａ－ＳＭＡ邋（４２邋ｋＤａ）逡逑＿逦|r呡邋Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ邋（２６３邋ｋＤａ）逡逑—逦Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ＩＶ邋（２００邋ｋＤａ）逡逑ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋ＧＡＰＤＨ邋（３７邋ｋＤａ）逡逑图１．１邋ＡＲＰＥ－１９细胞中ＥＭＴ标志性蛋白表达水平。逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－ｐ２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋细胞邋０ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑分别检测各时间点细胞中ａ－ＳＭＡ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和ｃｏｌｌａｇｅｎｌＶ的表达水平。ＧＡＰＤＨ逡逑作为蛋白上样内参对照。逡逑２３逡逑

表达水平,自噬,细胞内,转染

１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋细胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑结果显示自噬标志性蛋白ＬＣ３－ＩＩ、Ａｔｇ５－１２和Ｂｅｃｌｉｎｌ的表达水平逐渐增加，而自逡逑噬降解底物蛋白ｐ６２表达水平逐渐降低（图１．３）。同时，为了在细胞内直观观察逡逑自噬小体结构，我们在ＡＲＰＥ－１９细胞中转染ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ质粒，并分别在Ｏｎｇ／ｍ丨和逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－Ｐ２下作用２４ｈ，结果显示ＴＧＦ－Ｐ２刺激组平均每个细胞中绿色荧光斑逡逑点（自噬小体）数目显著增加，大约是对照组的５倍（图１．４）。逡逑２４逡逑

自噬,表达水平,细胞

逦ＴＧＦ－（３２（２４ｈ）逦ＴＧＦ－ｐ２（４８ｈ）逡逑图１．２邋ＡＲＰＥ－１９细胞形态变化。逡逑１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｐ２刺激ＡＲＰＥ－１９细胞Ｏｈ、２４ｈ和４８ｈ后，倒置相差显微镜分别逡逑记录各时间点细胞的形态。图中放大倍率＝４0ｘ。逡逑１．３．２邋ＡＲＰＥ－１９细胞ＥＭＴ过程中自噬水平变化逡逑１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋细胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑结果显示自噬标志性蛋白ＬＣ３－ＩＩ、Ａｔｇ５－１２和Ｂｅｃｌｉｎｌ的表达水平逐渐增加，而自逡逑噬降解底物蛋白ｐ６２表达水平逐渐降低（图１．３）。同时，为了在细胞内直观观察逡逑自噬小体结构，我们在ＡＲＰＥ－１９细胞中转染ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ质粒，并分别在Ｏｎｇ／ｍ丨和逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－Ｐ２下作用２４ｈ，结果显示ＴＧＦ－Ｐ２刺激组平均每个细胞中绿色荧光斑逡逑点（自噬小体）数目显著增加，大约是对照组的５倍（图１．４）。逡逑２４逡逑

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