人脐带间充质干细胞源性微囊泡对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经损伤的作用及机制的研究

发布时间：2020-09-17 12:14

　　目的:体外提取人脐带间充质干细胞源性微囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSCs-MVs)并观察hUCMSCs-MVs对糖尿病大鼠糖尿病视网膜神经损伤(diabetic retinal neurodegeneration,DRN)的作用及机制。方法:本实验分3部分,第1部分进行hUCMSCs传代培养,收集细胞培养上清液,利用超速离心法提取hUCMSCs-MVs,流式细胞仪、透射电镜等研究方法对hUCMSCs-MVs进行形态学及免疫学表型鉴定;第2部分为体外实验,实验分为4组:A组为正常对照组,B组高糖培养组(RGCs培养基内含浓度为33 mmol/L葡萄糖),C组为正常RGCs与hUCMSC-MVs共培养组,D组为高糖环境下RGCs与hUCMSC-MVs共培养组。通过免疫抗体包被筛选法及免疫荧光双染法对原代SD大鼠视网膜视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)进行分离及鉴定,观察hUCMSCs-MVs与RGCs的内化过程,CCK-8法、膜联蛋白-碘化丙啶(AnnexinV-PI)法、实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative real time time-reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫印迹试验(Western Blot,WB)等测定hUCMSCs-MVs对各组RGCs的活性及凋亡的影响及各组细胞内B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bax、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3基因水平及蛋白水平的相对表达量;第3部分为体内实验,实验分为4组:A组为正常对照组、B组为DM对照组、C组为正常对照+hUCMSCs-MVs玻璃体腔注射组、D组为DM+hUCMSCs-MVs玻璃体腔注射组。实验方法为腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,建模成功后8周各组行玻璃体腔内注射hUCMSCs-MVs,注射后观察时间为4周。利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察内层视网膜结构改变,原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)观察DR大鼠内层视网膜细胞凋亡情况,免疫荧光双染法定性及定位磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)在视网膜内的表达情况,WB法测量目的蛋白JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、裂解Caspase-3(Cleaved Caspase-3)的相对表达量。结果:成功提取hUCMSCs-MVs,通过透射电子显微镜及流式细胞仪对hUCMSCs-MVs进行形态及免疫学鉴定,观察到hUCMSCs-MVs直径介于10~2-10~3nm,为圆形膜性囊泡样结构,高表达hUCMSCs特异性蛋白CD44、CD29、CD73、CD105,阴性表达整合素(integrin,CD49f)、HLA class II(HLA-DR)及造血干细胞特异标记蛋白CD34、CD45。hUCMSCs-MVs的分泌效率为接种密度约1×10~5/ml、第2代-第4代(P2-P4)hUCMSCs培养上清液约300ml可提取蛋白质量约342.65?1.32μg的hUCMSCs-MVs。成功完成原代SD大鼠RGCs体外培养及鉴定,证明体外RGCs可与hUCMSCs-MVs良好内化。CCK-8及AnnexinV/PI双染法检测结果显示,B组细胞活性低于A、C、D组,B组细胞凋亡率高于A、C、D组,差异均有统计学意义(P0.05)。RT-PCR及WB检测结果显示,B、D组RGCs、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量高于A、C组,差异有统计学意义(P0.05),SNK-q组间比较结果显示D组RGCs内Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量高于B组,B组Bax、Caspase-3及Cleaved-Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量高于D组,差异均具有统计学意义。STZ诱导建立DM大鼠模型,建模成功8周后大鼠视网膜切片HE染色可见糖尿病性视网膜病变;玻璃体腔注射hUCMSCs-MVs后4周,观察4组大鼠内层视网膜厚度改变,4组差异具有统计学意义(P0.05),SNK-q检验示B组内层视网膜厚度低于其余3组,D组视网膜厚度高于B组。4组大鼠内层视网膜TUNEL染色阳性(TUNEL~+)细胞表达率差异具有统计学意义(P0.05),SNK-q检验分析结果显示B组大鼠内层视网膜内TUNEL~+细胞表达率高于其余各组,D组内层视网膜内TUNEL~+细胞表达率低于B组。免疫荧光定位结果显示早期DR大鼠视网膜内JNK的活化主要内层视网膜GCL,merge荧光融合后可见表达于RGCs胞浆内。4组间视网膜p-JNK阳性(p-JNK~+)表达率差异具有统计学意义(P0.05),SNK-q检验结果显示B组大鼠内层视网膜内p-JNK~+表达率高于其余各组,D组GCL内的p-JNK~+表达率低于B组。WB结果显示4组间目标蛋白相对表达量差异均具有统计学意义(P0.05),SNK-q检验结果显示B组Bcl-2相对表达量低于其余3组,B组JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量高于其余3组,D组JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量高于D组。结论:体外hUCMSCs-MVs可通过降低高糖环境下RGCs凋亡相关蛋白的表达发挥对高糖环境下RGCs损伤的保护作用;玻璃体腔注射hUCMSCs-MVs可通过增加视网膜内Bcl-2表达、降低JNK/Bax/Caspase-3的表达及活化,降低早期DR大鼠RGCs凋亡及内层视网膜萎缩,发挥对DRN的保护作用。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R774.1
【部分图文】：

细胞,细胞融合,多角形,梭形

1：A-D 为光学显微镜下观察 hUCMSCs 细胞传代培养后 1d、3d、5d、7d 的细胞 1d 细胞基本贴壁，3-5d 细胞成长梭形或多角形，7d 细胞融合率为 80%（×200）.2 绘制 hUCMSCs 细胞生长动力曲线依据细胞培养天数及细胞吸光度值 A 绘制的细胞生长曲线，细胞接种天处于不同生长时期，即生长缓慢的潜伏期、斜率较大的生长期、呈平顶期。从生长曲线观察，1-3 天 A 值缓慢增加，细胞呈现缓慢生长，为的潜伏期。3-5 天吸光度 A 值曲线斜率增加，细胞生长迅速，为细胞对。5 天后细胞生长曲线变得平坦，即细胞生长缓慢，为细胞增殖稳定期取 hUCMSCs 细胞稳定期即培养 5-7 天的 hUCMSCs 培养基MSCs-MVs（图 1.2）。

细胞生长曲线,吸光度,X轴,透射电子显微镜

图 1.2：hUCMSCs 细胞生长曲线图，X 轴为培养时间（天），Y 轴为吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形态学鉴定透射电子显微镜下观察 hUCMSCs-MVs，可见 3%磷钨酸负染背景hUCMSCs-MVs 为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构，未见双凹圆盘状构，颗粒膜结构完整，直径约为（102-103）nm，流式细胞仪检测可hUCMSCs-MVs 颗粒峰值主要位于（102-103）nm 直径范围（图 1.3）。图 1.3： hUCMSCs-MVs 透射电子显微镜像及流式细胞仪检测结果：透射电子显微镜像

细胞生长曲线,透射电子显微镜,流式细胞仪检测,膜性

图 1.2：hUCMSCs 细胞生长曲线图，X 轴为培养时间（天），Y 轴为吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形态学鉴定透射电子显微镜下观察 hUCMSCs-MVs，可见 3%磷钨酸负染背景下hUCMSCs-MVs 为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构，未见双凹圆盘状结构，颗粒膜结构完整，直径约为（102-103）nm，流式细胞仪检测可见hUCMSCs-MVs 颗粒峰值主要位于（102-103）nm 直径范围（图 1.3）。

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