脯氨酸羟化酶3在睡眠呼吸暂停低通气综合征导致的心脏纤维化中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-18 16:03

　　第一部分OSA动物模型构建与心脏功能的评估目的:睡眠呼吸暂停低通气综合征是指各种病因导致的每晚睡眠过程中呼吸暂停反复发作30次以上或睡眠呼吸暂停低通气指数(AHI)≥5次/小时伴有白天嗜睡等临床症状,以阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSA)最为常见。关于OSA的发病机制和并发症的研究,国内外主要是将小鼠、大鼠等小动物暴露于间歇性低氧环境中,从病理生理机制上模拟OSA造成的间歇性低氧。本部分研究的目的就是建立OSA动物模型并评估模型鼠的心脏功能。方法:购买C57-BL/6J雄性小鼠,利用我们前期设计的间断低氧培养箱(专利号:ZL 2014 2 0484878.2)进行模型的构建,间断低氧设置:每分钟60个循环,其中用5s的时间将容器中的氧浓度下降到5%,继而维持20s;随后40s通入空气,将氧浓度上调到21%,每天持续8小时。阴性对照组的小鼠也置入同样的容器中,在同样的8小时中维持常氧。模型建立时间为3个月。利用心脏彩超检测各组小鼠的心功能,HE染色检测心脏组织切片的大体结构,Masson染色、天狼星红染色检测胶原蛋白的表达,免疫组织化学染色检测Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达。结果:3个月后我们发现:(1)二维超声图像显示,相对于对照组,IH组并没有改变小鼠心脏舒张期室间隔厚度和左心室舒张末期直径(p0.05),但是左心室的收缩末期直径增大(p0.05)和左心室后壁舒张末期的厚度变薄(p0.05)而且IH组的小鼠心脏功能(LVEF、FS、E/A、E’/A’)下降(p均0.01);(2)HE染色显示,相对于对照组,IH组小鼠心脏微血管的管壁厚度(IMT)与管腔直径的比值增大(p0.05);(3)Masson染色和天狼星红染色示,相对于对照组,IH组的小鼠的心脏微血管的管壁和周围胶原沉积水平明显增高(p0.05);(4)免疫组织化学染色显示,相对于空白组,IH组的Collagen Ⅰ的表达量明显增高(p0.05),但是并没有增加Collagen Ⅲ的表达量(p0.05)。结论:OSA可以导致心功能下降和心脏微血管纤维化第二部分PHD3改善OSA导致的心脏纤维化目的:目前临床上治疗OSA的唯一有效方法为持续气道正压通气(CPEP),然而有研究认为CPEP不能改善OSA合并心衰患者的住院率、生活质量也不能改善OSA合并心脏病患者的预后和死亡,所以必须寻找一个新的作用靶点来改善OSA导致的心脏纤维化,从而联合CPEP治疗来改善病人的住院率和生活质量。脯氨酸羟化酶3(PHD3)是一种细胞氧感受器,主要表达在神经元、心肌及肌肉组织。研究显示PHD3的功能具有两面性:一方面,常氧状态下,PHD3的表达增加导致细胞凋亡,而另一方面,在低氧状态下,PHD3的高表达可以促进细胞的存活和增殖并且对心肌缺血反应有至关重要的调控作用。然而PHD3是否对OSA导致的心脏微血管纤维化有保护或者损伤作用,目前尚无相关报道。本部分研究旨在探索PHD3在OSA导致的心脏微血管纤维化中的作用。方法:具体实验方法包括:慢病毒(干扰和过表达)的构建和感染;心脏彩超检测各组小鼠的心功能;HE染色检测心脏组织切片的大体结构,Masson染色、天狼星红染色检测胶原蛋白的表达;免疫组织化学染色检测Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达。结果:(1)过表达PHD3(Lv PHD3)的表达可以明显改善左心室的收缩末期直径(p0.05)、左心室后壁舒张末期的厚度(p0.05)和小鼠的心脏功能:LVEF(p0.05);FS(p0.05);E/A(p0.01);E’/A’(p0.01)。然而干扰PHD3(sh PHD3)的表达并不能改善上述的心脏指标(p0.05);(2)HE染色示:相对于Lv NC组,Lv PHD3组小鼠心脏微血管的管壁厚度(IMT)与管腔直径的比值有所改善(p0.05);(3)Masson染色和天狼星红染色检测示:相对于Lv NC组,我们发现Lv PHD3组的小鼠的心脏微血管的管壁和周围胶原沉积水平明显降低(p均0.05),然而sh PHD3不改变间断低氧导致的纤维化(p0.05);(4)免疫组织化学染色显示,相对于Lv NC组,Lv PHD3组的Collagen Ⅰ的表达量明显降低(p0.05),然而并没有改变Collagen Ⅲ的表达量(p0.05),有意思的是sh PHD3不改变间断低氧引起的Collagen Ⅰ表达升高(p0.05)。结论:PHD3可以改善OSA引起的心脏功能异常和心脏纤维化。第三部分PHD3通过改善内皮细胞的间充质转化从而改善心脏微血管的纤维化目的:2007年,Zeisberg.EM等人首次报道了心脏纤维化与内皮细胞来源的成纤维细胞的出现密切相关,提示在心脏纤维化过程中发生了内皮间充质化(End MT),而且内皮间充质转化导致的心脏纤维化的位置往往发生在心脏血管的管周和内皮下。第一部分研究发现,OSA导致的心脏纤维化主要发生在心脏微血管的中层和管周。第二部分研究发现,过表达PHD3可以明显降低OSA导致的小鼠心脏微血管纤维化水平,并改善小鼠的心功能,然而机制并不清楚。因此我们推测:PHD3的过表达很可能通过抑制End MT的发生从而改善OSA相关的心脏纤维化。该部分研究目的旨在探索PHD3改善OSA导致心脏纤维化的机制。方法:具体方法包括:小鼠体内实验免疫组织化学检测CD31和α-SMA;WB检测PHD3、Twist、Snail、CD31、α-SMA、VE-cadherin、FSP 1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达;细胞免疫荧光染色检测CD31、α-SMA、HIF-1α、p-smad2/3、smad2/3;Transwell检测内皮细胞和间充质化的内皮细胞的迁移能力。结果:(1)体内实验证实间断缺氧(IH)导致End MT:免疫组织化学染色示,control组的CD31染仅仅表达于血管内膜,而IH组的CD31的表达出现了一定程度的弥散,即IH组的CD31不仅仅表达在微血管的内膜上,还在血管中膜有一定程度的表达,control组α-SMA仅仅表达于微血管的中膜,在内膜并没有表达,而IH组的α-SMA不仅表达于微血管的中膜,同时在内膜也有了一定的表达。Wb显示,相对于control组,IH组的snail和twist(End MT激活的相关基因)表达明显升高(p均0.05);(2)体内实验PHD3可以改善IH导致的End MT:免疫组化示,Lv PHD3可以极大的改善IH导致的CD31的弥散表达和α-SMA的内膜表达。Wb显示相对于Lv NC组,Lv PHD3组的snail和twist的表达量明显降低(p均0.05);(3)体外实验IH诱导End MT:免疫荧光示,control组的细胞仅仅表达内皮细胞标志物CD31,而对于间充质细胞或者肌成纤维细胞表型的标志物α-SMA则几乎不表达,经过72h的间断低氧后,IH组的CD31表达有下降的趋势,而α-SMA的表达明显升高。Wb示相对于control组,IH组的snail和twist的基因表达明显升高(p均0.05);(4)体外实验PHD3改善IH诱导的End MT:Wb示,相对于control组,IH组可以升高间充质细胞标志物/肌成纤维细胞标志物α-SMA和FSP 1的表达(p均0.01),并降低内皮细胞标志物CD31和VE-Cadherin(p均0.01)的表达。Lv PHD3可以改善IH导致的上述指标的改变(p均0.01)。为了进一步证明上述结果snail和twist的表达被检测,wb示相对于Lv NC组,Lv PHD3组的snail和twist的表达量明显降低(p均0.05);(5)PHD3改善间充质化内皮导致的迁移能力和胶原分泌能力的增强:Transwell示,相对于control组,IH导致的间充质转化的内皮细胞迁移能力明显增强(p0.05),而Lv PHD3可以改善内皮细胞间充质化导致的迁移能力增强(p0.05)。为进一步探索细胞功能的改变,我们利用wb来检测内皮细胞分泌胶原的能力,wb示,相对于control组,IH组的细胞分泌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的能力明显增强(p均0.01),而Lv PHD3可以改善End MT导致的Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ分泌能力增强(p均0.01);(6)PHD3可通过调节HIF-1α改善IH诱导的End MT:Wb示相对于control组,IH组的HIF-1α表达量明显的升高(p0.05),然而Lv PHD3可以改善IH造成的HIF-1α表达升高(p0.05)。免疫荧光示control组的HIF-1α主要表达于细胞质,少部分表达于细胞核,而IH组的HIF-1α主要表达于细胞核中,Lv PHD3可以抑制IH导致的HIF-1α核转位;(7)PHD3可通过调节Smad2/3改善IH诱导的End MT:免疫荧光示control组的p-smad2/3仅仅表达在细胞质中,smad2/3大部分表达于细胞质中少部分表达于细胞核中,而IH组的p-smad2/3和smad2/3出现了明显的核转位,Lv PHD3可以抑制IH导致的p-smad2/3和smad2/3核转位,为了进一步验证我们的结论,利用smad2/3的抑制剂来抑制p-smad2/3的活性。加入抑制剂阻断smad2/3后,wb示相对于IH组,CD31的表达升高(p0.05),α-SMA(p0.05)、snail(p0.01)、twist(p0.01)的表达降低。结论:(1)PHD3通过改善内皮细胞的间充质转化从而改善心脏微血管的纤维化;(2)PHD3改善IH导致的End MT与降解和灭活HIF-1α有关;(3)PHD3改善IH导致的End MT与灭活p-smad2/3有关。第四部分PHD3通过改善平滑肌去分化从而改善心脏微血管的纤维化目的:本研究的第三部分认为PHD3通过抑制End MT的发生从而改善OSA导致的心脏纤维化。有研究推测,内皮细胞来源的肌成纤维细胞所占到的比例高达30%,也就是说还有其他来源肌成纤维细胞。体内实验我们利用慢病毒来干扰和过表达小鼠心脏的PHD3表达水平,然而慢病毒在感染心脏时并没有特异性,所以PHD3改善OSA导致的心脏纤维化可能不仅仅作用于内皮细胞。研究表明血管平滑肌细胞(VSMC)具有表型转化的功能,VSMC的过度增殖和胶原的分泌可能是血管管腔狭窄的一个重要的原因。本研究第一部分发现,OSA导致的心脏纤维化主要发生在心脏微血管的中层和管周,所以我们推测PHD3改善OSA导致的心脏纤维化可能与心脏血管的VSMC有关。该部分研究目的旨在进一步探索PHD3改善OSA导致心脏纤维化的机制。方法:具体方法包括:体内实验免疫组织化学检测OPN和α-SMA;WB检测PHD3、α-SMA、OPN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达;细胞免疫荧光染色检测α-SMA、HIF-1α;si RNA的制备和转染;RT-q PCR检测HIF-1αm RNA水平。结果:(1)体内实验证实IH导致平滑肌去分化:免疫组织化学染色示,control组心脏微血管的中层几乎不表达OPN,而IH组的心脏微血管中层的OPN表达明显升高(p0.01),相对于control组,IH组的α-SMA的表达几乎没有变化(p0.05);(2)体内实验证实PHD3改善IH导致的平滑肌去分化:免疫组化示,相对于Lv NC组,Lv PHD3可以明显的改善IH导致的心脏微血管中层的OPN表达升高(p0.01);(3)体外实验证实IH导致平滑肌去分化:免疫荧光示,空白组的细胞仅仅表达收缩型标志物α-SMA,而对于合成表型的标志物则几乎不表达,72h的间断低氧后,IH组的平滑肌细胞开始表达合成型的标志物OPN。(4)体外实验证实PHD3改善IH导致的平滑肌去分化:Wb结果显示,相对于control组,IH组可以明显的升高合成型细胞标志物OPN的表达(p0.05),并降低收缩型标志物α-SMA的表达(p0.01)而Lv PHD3可以改善IH导致的OPN表达升高(p0.05)和α-SMA的表达降低(p0.01);(5)PHD3改善平滑肌去分化导致的胶原分泌增强:Wb示相对于control组,IH组的细胞分泌Collagen Ⅰ的能力明显增强(p0.05),然而并不能改变Collagen Ⅲ的分泌能力(p0.05),Lv PHD3可以明显的改善平滑肌去分化导致的Collagen Ⅰ分泌能力增强(p0.05);(6)PHD3通过抑制和灭活HIF-1α改善IH导致的平滑肌去分化:RT-q PCR示相对于control组IH组没有改变HIF-1αm RNA的水平,而sh PHD3和Lv PHD3也没有改变HIF-1αm RNA的水平(p均0.05)。Wb示,相对于control组,IH组的HIF-1α表达量明显的升高(p0.01),然而Lv PHD3可以改善IH造成的HIF-1α表达升高(p0.01)。免疫荧光示,control组的HIF-1α主要表达于细胞质,少部分表达于细胞核,而IH组的HIF-1α则产生了明显的核转位,Lv PHD3可以有效抑制IH导致的HIF-1α核转位。为进一步验证上述结果,我们利用小干扰来干扰HIF-1α的表达,wb示,si HIF-1α组能很好的改善IH导致平滑肌去分化导致的α-SMA表达降低和OPN的表达升高(p均0.05)。结论:(1)PHD3通过改善平滑肌细胞的去分化从而改善心脏微血管的纤维化;(2)PHD3改善IH导致的平滑肌去分化与调控转录后的HIF-1α有关。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R766;R54
【部分图文】：

示意图,培养箱,小鼠,面板

东南大学博士学位论文26三结果1. CIH 动物模型的制备示意图利用既往已经获得国家发明专利的慢性间歇缺氧动物培养箱进行造模（图1）。并对培养箱内的氧浓度进行实时监测。图 1：小鼠间断低氧培养箱及控制面板2. 心脏彩超示 CIH 影响心脏功能间断低氧 3 个月后，给与小鼠行超声心动图检查。二维超声图像显示，相对于对照组，IH 组并没有改变小鼠心脏舒张期室间隔厚度和左心室舒张末期直径（p>0.05，图 2A2b1b2）。但是相对于对照组，左心室的收缩末期直径增大（2.8±0.2 VS 1.89±0.17 p<0.05，图 2A2b3）和左心室后壁舒张末期的厚度变小（0.77±0.06 VS 0.89±0.03 p<0.05，图 2A2b4）。相对于对照组，IH 组的小鼠心脏功能有所下降：LVEF（53.67±3.1% VS 75.67±4.1% p<0.01，图 2A2b5）；FS（25±2% VS 39.3±2.1% p<0.01

二维图,心脏功能,小鼠

图 2 IH 损伤小鼠心脏功能。A 典型的心脏彩超二维图、M 超图、PW 图和组织多普勒图。B心脏彩超各个数据的半定量分析 b1 IVSD；b2 LVIDD；b3 LVIDs；b4 LVPWd；b5 LVEF%；b6 FS%；b7 E/A; b8 E’/A’ 数据以均数±标准差的形式表示，n=8/每组，*p<0.05 VS control**p<0.01 VS control3. 组织病理学示 CIH 导致心脏微血管重构和心脏纤维化间断低氧 3 个月后，给与小鼠心脏组织病理学染色。HE 染色显示，相对于对照组，IH 组小鼠心脏微血管的管壁厚度（IMT）与管腔直径的比值增大（0.23±0.03 VS 0.14±0.02 p<0.05，图 3A3b1）。然后我们利用 Masson 染色和天狼星红染色检测小鼠心脏的胶原水平，相对于对照组我们发现 IH 组的小鼠的心脏微血管的管壁和周围胶原沉积水平明显增高，半定量分析增高了约 2.05 倍（Masson 染色）（0.37±0.07 VS 0.18±0.05 p<0.05，图 3A3b2）和 1.84 倍（天狼星

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然后我们对胶原表达部位进行了分析，我们发现胶原的表达量增高的部位集中于心脏微血管的管壁和管周（图 3），而心肌以及心肌间隙中并没有表达过多的胶原（图 4）。也就是说长时间的间断低氧仅仅能导致心脏微血管的重构而不能导致心肌以及心肌间隙的胶原沉积。

【参考文献】