姜黄素在慢性间歇低氧诱导小鼠脑损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-19 09:22

　　目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是以睡眠中上气道反复塌陷为特征的综合症,最终导致慢性间歇低氧和睡眠障碍。OSAHS最主要的病理生理过程是慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),可以引起多脏器功能损伤,其中OSAHS引起的脑损伤是近期人们关注的热点。OSAHS与许多神经系统疾病相关,例如中风、脊髓损伤以及神经退行性变,这提示OSAHS可能在神经系统损伤的病理机制中发挥重要作用。然而,这些机制并不完全清楚。有文献报道OSAHS可以导致神经元凋亡,星形胶质细胞反应性增生及脑水肿等,结构的改变必然导致神经功能的异常。星形胶质细胞是脑内的主要支持营养细胞,支持神经细胞存活。因此靶向抑制星形胶质细胞向促炎表型的转化,可能为脑损伤提供神经保护作用。水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)是脑内重要的水转运蛋白,不仅调控病理和生理状态下脑水平衡,而且与神经炎症有着密切的关系。考虑到CIH可以引起脑水肿,反应性星形胶质细胞增生,而且AQP4主要表达在星形胶质细胞足突上,我们推测AQP4的表达变化可能与CIH造成的脑损伤相关,目前尚无CIH诱导脑损伤与AQP4的相关报道。p38MAPK信号通路在神经系统调节神经炎症方面发挥重要作用,可能参与调节了星形胶质细胞向促炎型转化的生物学功能。p38 MAPK信号通路的激活与星形胶质细胞中AQP4的表达也密切相关。以往的研究表明,p38MAPK通路参与IL-1β和TNF-α诱导的AQP4表达,从而影响创伤性脑损伤后的脑水肿。MAPK家族在各种低氧环境下有选择性的被激活,CIH/OSAHS激活了p38MAPK信号通路,可造成海马区神经细胞损伤。综上我们推测CIH诱发的脑损伤,可能与p38MAPK的活化及AQP4的表达相关,目前尚无报道,有待进一步研究。姜黄素(curcumin)是在植物姜黄中发现的一种天然多酚化合物,发挥着抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用,并且姜黄素可以穿透血脑屏障,对神经系统具有很好的保护作用。近期研究显示姜黄素在脑外伤,脑缺血再灌注,脑出血及COPD等多种脑损伤模型中通过调控AQP4的表达减轻脑水肿。也有文献报道,姜黄素影响星形胶质细胞中p38通路的活化,目前姜黄素在CIH相关脑损伤的作用机制尚不清楚。因此我们推测AQP4和p38 MAPK信号通路可能参与了姜黄素在CIH诱导的脑损伤中的保护作用,这些都有待进一步证实。本研究旨在通过体内实验模拟OSAHS/CIH的低氧特点,建立CIH小鼠模型,动态观察CIH致小鼠脑损伤的炎症反应及病理生理学变化特点,评价姜黄素对CIH相关脑损伤的保护作用,从而探讨p38MAPK信号通路及AQP4是否参与姜黄素对CIH脑损伤保护作用的相关机制;并且通过体外实验建立原代星形胶质细胞模型,进一步研究p38 MAPK/AQP4信号通路在低氧所致的星形胶质细胞损伤中的作用及姜黄素的保护机制,从而验证姜黄素对CIH小鼠脑损伤的保护作用是否部分是通过调节p38MAPK/AQP4通路的活性来实现的。方法:1、CIH致小鼠脑损伤的动态观察SPF级Balb/c小鼠144只,按随机数字表法将小鼠随机分为常氧对照组(control,n=72),慢性间歇低氧组(CIH,n=72),CIH动物被放置在低氧舱中,低氧舱的模式设置为5%-21%氧浓度交替给予,每180秒为1个循环,包括维持低氧50秒及常氧50秒,这种循环模式相当于每小时20次低氧-复氧单循环,最低氧浓度达到5%,每天连续进行8小时(from9:00a.m.to 5:00 p.m.),分别观察0W、4W、8W及10W。在观察点结束时,观察小鼠的一般状态,体重及脑湿干比重变化,利用皮质酮检测试剂盒检测血清皮质酮浓度,通过ELISA法检测脑组织中TNF-α,IL1-β含量,观察小鼠脑皮质HE染色,TUNEL染色评价神经元细胞损伤及凋亡程度,利用GFAP免疫组化染色比较星形胶质细胞形态学及GFAP表达量改变,通过上述指标系统分析CIH小鼠脑损伤的动态演变特点。2、姜黄素在CIH致小鼠脑损伤中的作用及机制研究雄性SPF级Balb/c小鼠90只,按随机数字表法将小鼠分成5组(n=18):常氧对照组(Control),慢性间歇低氧组(CIH),50mg/kg姜黄素治疗组[CIH+Cur(50mg/kg)],100mg/kg姜黄素治疗组[CIH+Cur(100 mg/kg)]和200mg/kg姜黄素治疗组[CIH+Cur(200 mg/kg)]。按照第一部分方法制备CIH小鼠模型,小鼠连续间歇低氧10W。各CIH组在每日间歇低氧前分别接受了不同剂量的姜黄素(0,50,100,or200mg/kg,灌胃法)。在观察点结束时,通过观察小鼠的一般状态,体重及脑湿干比重变化,利用皮质酮检测试剂盒检测血清皮质酮浓度,通过ELISA法检测脑组织中TNF-α,IL1-β含量,观察小鼠脑皮质,脑干及小脑各部位HE染色,TUNEL染色,评价神经元细胞损伤及凋亡程度,利用GFAP免疫组化染色比较星形胶质细胞形态学及GFAP表达量变化,通过上述指标评价姜黄素对CIH致脑损伤的保护作用。再此基础上,通过Western Blot及qPCR方法从蛋白水平,基因水平检测脑组织AQP4的表达变化,及利用Western Blot方法检测p38MAPK信号通路关键分子包括MKK3,p-MKK3,MKK6,p-MKK6,p38MAPK,p-p38MAPK及CHOP的表达变化,进一步探讨AQP4及p38MAPK通路是否参与了姜黄素对CIH脑损伤的保护机制。此外通过免疫荧光双染观察脑组织星形胶质细胞上AQP4及p-p38MAPK表达变化的相关性。3、p38 MAPK/AQP4信号通路在低氧诱导星形胶质细胞损伤中的作用及姜黄素的保护机制采用原代培养的星形胶质细胞作为细胞模型。首先对原代星形胶质细胞进行分离、纯化及鉴定。免疫荧光染色GFAP检测细胞纯度,纯度90%可用于后续实验。实验分为常氧组和低氧组,常氧组包括常氧对照组、常氧+姜黄素组和常氧+p38抑制剂组;低氧组包括低氧对照组、低氧+姜黄素组、低氧+p38抑制剂组。根据分组对细胞分别进行加药及低氧处理(1%O2)。3h培养结束后收集细胞进行后续检测。利用LDH试剂盒检测细胞培养上清液中LDH的含量,评估细胞损伤程度。通过免疫荧光双染,Western Blot及qPCR方法从蛋白水平,基因水平评估星形胶质细胞AQP4的表达变化,利用免疫荧光双染,Western Blot检测p38MAPK,p-p38MAPK蛋白表达变化。通过比较AQP4,p38MAPK及p-p38MAPK表达变化,进一步探讨姜黄素对低氧诱导的星形胶质细胞损伤中p38 MAPK信号通路活性及AQP4表达的影响及二者相互关系的验证。结果:1、CIH对小鼠脑损伤的动态演变特点利用低氧仓进行间歇低氧,成功建立小鼠CIH脑损伤模型。在0W、4W、8W及10W不同时间点,CIH小鼠呈现了不同的特征。小鼠精神萎靡,对外界刺激的反应明显迟钝。对抗外界阻力能力减弱,懒动,随着CIH时间延长而加重。4W、8W及10W组CIH小鼠体重与同周龄小鼠比较均明显下降(P0.05);血清皮质酮浓度及脑组织炎症因子TNF-α,IL1-β含量有逐渐上升趋势(P0.05),在8周达到高峰,10周与8周比较无统计学差异(P0.05)。脑湿干比重随着CIH时间延长逐渐升高,4W与对照组无显著差异(P0.05),8W,10W差异明显(P0.05),且10W达到脑水肿高峰。通过HE染色,我们可以观察到常氧对照组正常的神经元结构,有清晰的细胞核及核仁,而在CIH组,随着CIH时间的延长,神经元细胞逐渐出现形态学的改变,4W组细胞核仁浓缩,形态不规则。8W组细胞核内开始出现的空泡,并逐渐增大。10W组细胞核内形成典型的空泡征象,并且周围伴有炎性细胞浸润。这说明随着CIH时间的延长,神经元细胞出现不同程度的损伤,细胞水肿,病理改变逐渐加重且累及损伤神经元细胞数量逐渐增多;TUNEL染色结果显示与同周龄常氧对照组相比,CIH组表达阳性凋亡细胞的数量明显增加(P0.05),且分布广泛,凋亡程度随CIH时间延长而加重,组间比较,有明显统计学差异(P0.05);同样我们也能够观察到随着CIH时间的延长,星形胶质细胞逐渐出现形态学改变,表现出胞体增大,足突增粗等典型的胶质细胞反应性增生的特征,进一步通过半定量分析,证实GFAP表达水平随着CIH时间的延长而表达量明显增高,与对照组相比,4W、8W、10W组均有明显增高(P0.05),且组间比较也有统计学差异(P0.05)。2、p38MAPK信号通路和AQP4参与了姜黄素对CIH诱导脑损伤的保护作用的相关机制姜黄素干预组明显改善CIH小鼠的一般状态,体重的延迟增长,同时下调了血清皮质酮浓度,脑组织炎症因子TNF-α及IL1-β表达及降低了脑湿干比重,且中,高剂量组效果更明显,具有量效关系。我们也观察到姜黄素减轻了脑皮质,脑干及小脑各部位神经元的损伤及凋亡,抑制了星形胶质细胞的反应性增生及AQP4表达上调,且上述改变与姜黄素的剂量具有一定的量效关系。Western Blot结果提示CIH组可明显上调小鼠脑组织中MKK3,MKK6,p38MAPK的磷酸化蛋白即p-p38MAPK,p-MKK3,p-MKK6表达水平,而p38MAPK,MKK3,MKK6的总蛋白水平各组间无显著差异。姜黄素的干预(100 mg/kg、200mg/kg)可以抑制其磷酸化水平,表现为p-MKK3,p-MKK6,p-p38MAPK蛋白表达水平下调,且对姜黄素有一定的量效关系。通过免疫荧光染色我们也观察到姜黄素高剂量治疗组可以抑制在大脑皮质,小脑及脑干各部位CIH诱导的GFAP-AQP4,GFAP-p-p38MAPK共定位星形胶质细胞的数量增加。3、p38 MAPK/AQP4信号通路在低氧所致的星形胶质细胞损伤中的作用及姜黄素的保护机制低氧条件下可诱发细胞上清液LDH浓度升高,而p38抑制剂组及姜黄素组均可以抑制细胞上清液中LDH浓度升高;低氧可以诱发星形胶质细胞p-p38MAPK表达上调,p38MAPK抑制剂可以成功阻断低氧诱发的p-p38MAPK表达上调,而姜黄素也可以抑制低氧诱导p38MAPK磷酸化水平,下调p-p38MAPK蛋白表达含量。同时我们发现星形胶质细胞在低氧刺激下从蛋白和基因水平上可以上调AQP4表达,而p38MAPK抑制剂成功阻断低氧诱发的p-p38MAPK表达上调后,AQP4表达有所下降,说明在星形胶质细胞上低氧刺激可以激活p38MAPK/AQP4通路。有趣的是,姜黄素干预后,也抑制了低氧状态下星形胶质细胞上p38MAPK磷酸化水平及AQP4表达,这提示姜黄素可能通过抑制p38MAPK/AQP4通路减轻了低氧诱导的星形胶质细胞损伤。而在常氧对照组,常氧姜黄素组及常氧p38抑制剂组各项指标均无明显变化。结论:1、CIH可以诱导小鼠的应激状态(体重增长迟缓,血清皮质酮浓度升高),慢性炎症损伤(脑组织炎症因子表达TNF-α,IL1-β上调,脑水肿)及脑组织结构性的改变(神经元的损伤和凋亡、星形胶质细胞反应性增生),并且随着CIH时间的延长呈现逐渐加重的趋势。2、姜黄素可以通过降低CIH诱导的小鼠应激状态,缓解脑组织的慢性炎症损伤,减轻脑组织的结构改变进而发挥了一定的保护作用,并且这种保护作用体现在大脑皮质,小脑及脑干多部位,并且姜黄素存在一定的量效关系。3、姜黄素对CIH诱导脑损伤的保护作用与抑制p38MAPK信号通路活性及下调AQP4表达有关。体外实验验证了姜黄素通过抑制p38MAPK/AQP4通路减轻了低氧诱导的原代星形胶质细胞损伤,从而推测姜黄素对CIH小鼠脑损伤的保护作用部分可能是通过抑制了p38MAPK/AQP4通路的活性来实现的。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R766;R741

【参考文献】