增殖性糖尿病视网膜病变患者外周血转录组分析

发布时间：2020-09-24 10:35

　　目的:糖尿病视网膜病变是糖尿病最严重的并发症之一,并且是目前世界主要致盲眼病之一,随着糖尿病视网膜病变进展为增殖期,伴随着新生血管形成,牵拉因素将导致玻璃体积血和视网膜脱离,并最终造成不可逆的失明。就现在而言,增殖性糖尿病视网膜病变的最佳治疗方法是手术治疗,其原理为在解剖学上去除纤维血管膜带来的的牵拉效应,从而挽救患者的视力。为了寻找早期干预糖尿病视网膜病变的新靶点,从源头预防患者视力的大幅度下降,我们选择目前热门的RNA测序作为主要方法。RNA测序作为主要的转录组分析系统,通过它阐明人外周血转录组的复杂性,对于筛选增殖性糖尿病性视网膜病变的候选基因是必不可少的。方法:我们选择了天津医科大学眼科医院眼底病与眼外伤科的6名住院病人。根据我国糖尿病视网膜病变6级分期标准(1987),其中有3名患者被诊断为增殖期糖尿病视网膜病变(即PDR组),另外3名患者未患有糖尿病(即对照组)。对以上6名患者进行静脉采血,血液样本液氮冻存后送至诺和致源公司进行RNA测序。诺和致源公司经标准化流程提取外周血总RNA,经总RNA样本检测、文库构建、文库质检和测序后,我们得到了两组患者的原始数据。通过对原始数据的生物信息分析,我们得到了本次基因选择性表达的最终分析结果。结果:我们得到了两组患者的原始数据,即原始读段,在质量控制和序列比对之后,可得到正确读段,其数目在46111478-56703914之间,外显子区的读段分布率为86.7%-93.2%。进行基因表达水平分析和基因结构分析结果显示,PDR组与对照组之间有82个差异表达基因(p0.05,错误发现率q0.05),其中上调基因19个,下调基因63个,同组内基因表达模式相似。基因本体论和通路分析表明,这82种选择性表达的基因在特定的生物学过程得到富集。我们查阅文献和相关网站寻找与增殖、迁移、分化和新生血管形成功能有关联的基因,并结合本次RNA测序两组间相同基因选择性表达的结果,最终筛选出涉及不同生物学信号通路的26个候选基因。基于不同的生物信号通路如有丝分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路等,我们在这26个候选基因中选择了9个基因通过聚合酶链式反应进行进一步的验证,验证结果表明DUSP2和DUSP5是影响增殖性糖尿病视网膜病变形成的最有希望的候选基因。结论:本研究使用RNA测序探索了人类外周血转录组的复杂性,并且对测序结果进行了生物信息分析。最终,我们发现DUSP2和DUSP5可能与增殖性糖尿病视网膜病变有关,而RNA测序也可能成为探索治疗疾病新靶点的常用方法。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R774.1
【部分图文】：

示意图,基因,示意图,引物

入适量的 DEPC 水溶解引物干粉，将其变为 100mM 体系，再按照需求按 1:1:3的比例对应取上游引物、下游引物和 DEPC 水适量，加入 EP 管混匀待用。此时EP 管中为 20mM 的上、下游引物混合物。qRT-PCR 按标准程序进行。qPCR 的反应体系（8μL）为：每孔加入 cDNA模版 2μL，上、下游引物混合物共 2μL，Syb Green 4μL。注意加入 Syb Green 之后的步骤应避光进行。将 qPCR 用 384 孔板盖膜后压实，剪刀减去多余的膜以免进行反应时膜边缘卷起。4℃ 1200r 离心 5min 后上机。反应程序：50℃ 2min；95℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 个循环；95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s 解离。2.1.5 数据处理拷贝结果后，观察其 CT 值，采用 2 -ΔΔct 法分析数据。2.2 结果我们将两组的 CT 值进行对照，结果展示如图 1.

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