玻璃体切除术后晶状体上皮细胞的变化及茶多酚眼用凝胶干预作用的实验研究

发布时间：2020-09-28 14:06

　　 目的：观察玻璃体切除术后微环境的改变对兔晶状体上皮细胞线粒体活性氧、膜电位、内质网及Caspases-3表达的影响及茶多酚眼用凝胶干预后的变化，研究玻璃体腔微环境的改变对兔晶状体上皮细胞的影响及茶多酚眼用凝胶的干预作用，阐明玻璃体切除术后并发性白内障的发病机制及茶多酚眼用凝胶的效果。 方法：1.体外培养兔晶状体上皮细胞(Rabbit lens epithelial cells，RLECs)，分别采用BSS、硅油、O_2、C_3F_8制成特殊用途选择培养基，模拟体内玻璃体切除术后条件，加入不同浓度的茶多酚眼用凝胶进行干预，观察玻璃体腔微环境的改变对兔晶状体上皮细胞形态的变化。2.配制含终浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0μg/ml茶多酚眼用凝胶的培养基体外培养兔晶状体上皮细胞，通过CCK-8法筛选出适合细胞生长的茶多酚眼用凝胶的安全浓度。3.实验分为四组：A组(正常RLECs)-正常组，B组(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8)-对照组，C组(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+10μg/ml茶多酚眼用凝胶)，D组(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+100μg/ml茶多酚眼用凝胶)。4.通过流式细胞仪检测线粒体活性氧、膜电位的情况，免疫荧光化学检测内质网的表达情况及免疫组化检测凋亡相关蛋白Caspases-3蛋白表达变化，进而研究玻璃体切除术后并发性白内障的发病机制及茶多酚眼用凝胶的效果。 结果：1.倒置相差显微镜下见：体外培养的兔晶状体上皮细胞呈梭形或多边形，单层贴壁生长，细胞边界清楚。2. CCK-8法检测显示：(1)加入终浓度为1000μg/ml的茶多酚眼用凝胶组OD值明显低于单纯晶状体上皮细胞组，差异有统计学意义(P0.05)；(2)加入终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的茶多酚眼用凝胶组与单纯晶状体上皮细胞组OD值未见明显差异，无统计学意义(P0.05)。3.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8损伤模型建立后，倒置相差显微镜下观察A~D组细胞见：A组细胞呈梭形或多边形，单层贴壁生长，细胞边界清楚。B组一些细胞体积缩小、变圆，折光性改变，细胞周围见透亮圈；细胞核缩小，分裂为多个或出现核边聚；培养液中出现圆形悬浮细胞及细胞碎片。C~D组细胞呈梭形或多边形，单层贴壁生长，细胞边界清楚，少许细胞体积缩小、变圆，折光性改变，培养液中未出现圆形悬浮细胞及细胞碎片。4.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培养条件下的上皮细胞线粒体活性氧产生增多，而应用茶多酚眼用凝胶干预组活性氧的产生明显减少。5.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培养条件下的上皮细胞线粒体膜电位降低；而茶多酚眼用凝胶干预组细胞线粒体膜电位升高。6.经免疫荧光检测，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培养条件下晶状体上皮细胞中内质网的阳性率明显降低，而应用茶多酚眼用凝胶干预后内质网的阳性率明显升高。7.经免疫组化检测，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培养条件下晶状体上皮细胞中Caspases-3表达明显，而应用茶多酚眼用凝胶干预后Caspases-3表达明显降低。 结论：玻璃体切除术后微环境的改变引发晶状体上皮细胞的凋亡，上皮细胞的凋亡是玻切术后并发性白内障发生的原因之一，而茶多酚眼用凝胶能够有效抑制上皮细胞线粒体活性氧水平，保护线粒体膜电位及内质网的功能，降低细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶Caspases-3表达水平，从而抑制晶状体上皮细胞凋亡。保护晶状体上皮细胞免受损害，维持其结构和功能的正常，从而可能延缓玻切术后并发性白内障的发生。
【学位单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R779.6
【部分图文】：

培养6d的RLECs (100×) 培养8d的RLECs (100×)培养10d的RLECs (100×) 培养14d的RLECs (100×)图1-1 原代培养兔晶状体上皮细胞的生长过程1.4.2 兔晶状体上皮细胞的传代培养原代兔晶状体上皮细胞生长周期较长，在10~14d时可达到80%汇合状态，可用作进一步实验。传代后1w左右可再次传代，传至第5代时细胞开始发生转化变为成纤维细胞，呈梭形或见伪足向外伸展，此时不可作进一步实验。见图1-2

6传2代RLECs (200×) 传5代RLECs (200×)图1-2 传代兔晶状体上皮细胞生长过程1.4.3 CCK-8法检测不同浓度茶多酚眼用凝胶对兔晶状体上皮细胞活性的影响显示：第1组OD值明显低于其他组，统计学具有显著差异，P<0.05。见表1-1表1-1 不同浓度茶多酚眼用凝胶对RLECs活性的影响GROUP N OD 值第1组 5 0.031±0.0069*第2组 5 0.058±0.0137第3组 5 0.064±0.0077第4组 5 0.069±0.0077第5组 5 0.076±0.0093*表示与其他组比较P<0.051.5 讨论并发性白内障是玻璃体切除术后的一种常见并发症，晶状体上皮细胞是其主要靶位。通过体外培养兔晶状体上皮细胞，改变培养条件，模拟体内玻璃体腔微环境改变的特点，是研究玻切术后并发性白内障重要而有效的手段。在无菌条件下分离出晶状体前囊膜，经适当处理后置于合适的条件进行培养，是晶状体上皮细胞培养成功的关键。晶状体上皮细胞体外培养为克隆样贴附型生长，细胞形态为扁平的多角形，其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，呈“铺路石”状，细胞多为单层，且存在接触抑制和密度抑制现象。晶状体的组织结构可分为：晶状体囊、晶状体前囊上皮细胞、结合质、晶状体纤维、晶状体悬韧带[1]。晶状体是一个独特的器官

细胞变得稀疏。见图2-1BSS培养4d的RLECs (200×) 硅油培养4d的RLECs (200×)O2培养4d的RLECs (200×) C3F8培养4d的RLECs (200×)图2-1 BSS、硅油、O2、C3F8培养基中的兔晶状体上皮细胞1.2.2 不同浓度茶多酚眼用凝胶对BSS、硅油、O2、C3F8培养的兔晶状体上皮细胞干预的影响BSS、硅油、O2、C3F8培养的兔晶状体上皮细胞，在含终浓度分别为10μg/ml、100μg/ml的茶多酚眼用凝胶培养基中，上皮细胞较好的保持了原有的细胞形态，细胞之间紧密相靠，互相衔接，排列规则，较少出现细胞肿胀、空泡和颗粒等，细胞未见稀疏。见图2-2

【参考文献】

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本文编号：2828886