microRNA在β-榄香烯抑制小鼠视网膜新生血管形成中的异常表达及其分子机制的实验研究

发布时间：2020-10-01 15:34

　　目的:通过建立高氧诱导的视网膜新生血管的动物模型,观察β-榄香烯对小鼠视网膜新生血管的抑制作用。在此基础上应用快速有效的miRNA基因芯片技术,检测正常对照组、模型组、治疗组三组小鼠视网膜组织的miRNA表达差异,应用生物信息学方法及荧光素酶报告基因检测系统初步解析β-榄香烯抑制小鼠视网膜新生血管生成的分子机制。方法:将C57BL\6J7日龄小鼠36只随机分为正常对照组、模型组、治疗组各12只。模型组和治疗组在高氧环境中建立视网膜新生血管动物模型,治疗组在生后第12天眼内给予玻璃体腔内注射β-榄香烯1ul后,在生后第17天三组分别摘除眼球,进行HE染色、ADP酶视网膜铺片以及透射电镜下观察视网膜组织超微结构变化,评价β-榄香烯抑制鼠视网膜新生血管的作用。提取三组小鼠视网膜组织,分别置于加有Trizol溶液的Ep管中,干冰保存送往上海康成生物有限公司进行miRNA检测,筛选出正常组、模型组、治疗组中视网膜组织表达显著差异的microRNAs。根据芯片检测结果,设计mir-23a、mir-22、mir-93、mir-106a、mir-19b、mir-190b、mir-34a的茎环引物进行SYBR Green Real-time PCR相对定量法测定,应用TargetScan、Miranda、RNA hybrid三种软件对上述7种microRNAs进行靶基因的预测。通过Real-time PCR技术检测正常组、模型组、治疗组小鼠视网膜组织中VEGF的mRNA表达量,免疫组化方法检测三组视网膜组织中VEGF蛋白表达量。获得小鼠VEGF 3’UTR片段1800bp(包含mir-23a与VEGF相结合的作用位点),插入荧光素酶表达载体中,构建重组荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT-VEGF,与mir-23a mimic共转染人胚肾细胞(HEK)293细胞,48h后收集细胞裂解液,测定荧光素酶活性观察mir-23a对外源性靶基因表达的抑制作用。同时共转染?-半乳糖苷酶(?-galactosidase)质粒,检测?-galactosidase活性以校正组间转染效率的差异,同时以RNA双链寡核苷酸及空质粒转染作为阴性对照。芯片结果采用miRCURYLNA基因芯片管理平台GenePix Pro 6.0 software软件建立实验信息,采用Volacano Plot filtering对各张芯片信号值进行频率分布分析,Fold change1.5或0.67,认为miRNA在组间有差异性表达,数据经过统计学处理P0.05认为miRNA在组间表达差异具有统计学意义;用MEV软件进行聚类分析,其他数据应用SPSS16.0软件处理和分析数据,P0.05表示差异具有显著性。结果:1、形态学检查结果(1)组织学检查及视网膜血管内皮细胞计数:各组小鼠生后第17天视网膜组织切片HE染色:光镜下观察并计数突出内界膜的内皮细胞核个数,即新生血管内皮细胞数,正常对照组偶见突出内界膜的内皮细胞核,平均每张切片突出内界膜的血管内皮细胞核数为(0.23±0.11)个;OIR模型组见大量突出内界膜的内皮细胞,平均每张切片突出内界膜的血管内皮细胞核数为(30.73±5.11)个,与正常组相比较差异有统计学意义(P〈0.001)。治疗组平均每张切片突出内界膜的血管内皮细胞核数为(12.13±0.19)个,较其对侧眼明显减少,两组相比较差异有统计学意义(P〈0.05),与模型组比较也明显减少,差异有统计学意义(P〈0.05)。组织切片检查未见毒性反应。(2)ADP酶视网膜铺片:正常对照组生后第17天视网膜血管从视乳头发出后,向四周呈放射状均匀分布,直至视网膜周边部;而OIR模型组生后第17天视网膜中周部见新生血管形成,后极部可见大片无灌注区,血管走形迂曲;治疗组生后第17天视网膜新生血管较OIR模型组明显减少,血管扩张迂曲好转。(3)透射电镜下超微结构变化:正常对照组视网膜超微结构未见异常改变;OIR模型组双极细胞线粒体肿胀、嵴脱落、空泡样变,感光细胞膜盘间隙增宽、数量减少,神经节细胞线粒体肿胀、嵴脱落、空泡样变;治疗组视网膜超微结构趋于恢复正常。2、确认在正常对照组、模型组、治疗组小鼠视网膜组织表达有变化的miRNA种类(1)与正常组相比,模型组中共检测出54个差异表达的microRNAs,其中43种microRNA表达下调,11种microRNA表达上调,其中差异明显(差异倍数5,P0.05)下调的miRNA有3个,包括mir-22、mir-23a、mir-190b。(2)与模型组相比,治疗组中共检测出54个差异表达的microRNAs,其中44种microRNA表达上调,12种microRNA表达下降,其中差异明显(差异倍数3,P0.05)上调的miRNA有5个,包括mir-22、mir-23a、mir-181a-1*、mir377、mir17*;下调的miRNA有3个,包括mir-872、mir-19b、mir-26b。(3)在疾病模型发生过程及治疗过程中表达均发生差异的microRNAs芯片结果显示,43种microRNAs在疾病模型组中表达下降,其中23种microRNAs经治疗后表达有所增加,在模型组中表达上调的11种microRNAs中,miR-19b在治疗组中表达下降。(4)Real-time PCR验证部分差异表达的microRNAs,分别为miR-190b、miR-93、miR-106a、miR-22、miR-19b、miR-23a、miR-34a,与芯片筛选结果一致。3、miRNA的靶基因预测及确认(1)靶基因预测结果:miR-23a与VEGF3’端UTR区存在结合位点,预测VEGF是miR-23a的靶基因之一。(2)免疫组化染色检测VEGF蛋白表达结果:采用光密度值表示,正常组32.17±20.98,模型组144.04±65.72,治疗组55.56±36.69,与正常组比较模型组VEGF表达上调(p0.01),与模型组比较治疗组中VEGF表达下降(p0.01)。(3)SYBR Green法实时定量PCR检测VEGF的mRNA水平结果显示:与正常对照组相比,模型组视网膜组织中VEGF表达量升高约5.31倍(P0.05),与模型组相比,治疗组中VEGF mRNA水平无明显变化(P0.05)。(4)实验组(PMIR-VEGF3’UTR质粒与miR-23a mimic共转染HEK293细胞)的相对荧光素酶活性较对照组(PMIR-VEGF3’UTR质粒与阴性对照mimic共转染HEK293细胞)降低约6倍(p0.0001),对于PMIR空质粒,实验组(PMIR-空质粒与miR-23a mimic共转染HEK293细胞)的相对荧光素酶活性较对照组(PMIR-空质粒与阴性对照mimic共转染HEK293细胞)无明显变化p0.05。结论:1、高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型成模率达100%,β-榄香烯对小鼠视网膜新生血管有明显抑制作用。2、利用miRCURYLNA芯片技术对C57BL\6J7日龄小鼠正常对照组、视网膜新生血管模型组、β-榄香烯治疗组三组视网膜组织进行miRNA表达差异的检测:与正常组相比,模型组表达明显(差异倍数5,P0.05)下调的miRNA有3个,包括mir-22、mir-23a、mir-190b;与模型组相比,治疗组表达明显(差异倍数3,P0.05)上调的miRNA有5个,包括mir-22、mir-23a、mir-181a-1*、mir377、mir17*,下调的miRNA有3个,mir-872、mir-19b、mir-26 b;我们发现在模型组中表达下调,治疗组表达上调的miRNA是mir-22、mir-23a、mir-34a、mir-19b、mir-181a-1*、mir-335-5 p、mir-433、mir-669n、mir-190、mir-93、mir-99b、mir-130b、mir-1274a、mir-135b、mir-151-5p、mir-153、mir-218、mir-361、mir-423-5p、mir-467g、mir-298、mir-767、mir-674等23种。这些microRNAs可能是β-榄香烯治疗视网膜新生血管的潜在机制之一,对视网膜新生血管的发生发展起着精细的调控作用。3、与模型组相比,治疗组中VEGF的mRNA表达水平无明显变化(P0.05),但是蛋白表达水平下降,说明VEGF受到了翻译及其以后水平的调控。4、体外实验表明:mir-23a可以抑制HEK293外源性VEGF的表达水平。提示mir-23a介导的VEGF水平下降参与了β-榄香烯对小鼠视网膜新生血管的抑制作用,初步阐明β-榄香烯可通过mir-23a调控的VEGF信号传导途径抑制视网膜新生血管的生成。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R774.1
【部分图文】：

切片图像,切片图像,内界膜,光镜

中国医科大学博士学位论文3 结果.1 组织学检查及视网膜新生血管内皮细胞核计数各组小鼠生后第 17 天视网膜组织切片 HE 染色，光镜下观察并计数突出内界新生血管内皮细胞核个数，正常对照组偶见突出内界膜的内皮细胞核，平均每片突出内界膜的血管内皮细胞核数为（0.23±0.11）个（图 1A）；OIR 模型组见突出内界膜的内皮细胞，平均每张切片突出内界膜的血管内皮细胞核数30.73±5.11）个（图 1B），与正常组相比较差异有统计学意义（P〈0.001）；治平均每张切片突出内界膜的血管内皮细胞核数为（12.13±0.19）个（图 1C），型组相比较差异有统计学意义（P〈0.05)。组织切片检查未见毒性反应。

ADP酶,铺片,视网膜,光镜

A B C图 2 光镜下观察视网膜铺片 ADP 酶染色结果×200。A 为正常对照组小鼠在生后第 17 天视网膜血管从视乳头发出后，向四周呈放射状均直至视网膜周边部；B 为 OIR 模型组视乳头周围及后极部可见大面积无灌注区形成；组视网膜新生血管较 OIR 模型组明显减少。电镜观察OIR 模型组感光细胞外节膜盘间隙增宽，排列紊乱，数量减少; 神经节细肿胀、嵴脱落、空泡样变(图 4)；双极细胞线粒体肿胀、嵴脱落、空泡样组视网膜超微结构趋于恢复正常（图 5）；正常对照组视网膜超微结构未见（图 6）。

网膜,电镜,三级,视网膜

A B C图 2 光镜下观察视网膜铺片 ADP 酶染色结果×200。为正常对照组小鼠在生后第 17 天视网膜血管从视乳头发出后，向四周呈放射状至视网膜周边部；B 为 OIR 模型组视乳头周围及后极部可见大面积无灌注区形成视网膜新生血管较 OIR 模型组明显减少。电镜观察IR 模型组感光细胞外节膜盘间隙增宽，排列紊乱，数量减少; 神经节胀、嵴脱落、空泡样变(图 4)；双极细胞线粒体肿胀、嵴脱落、空泡视网膜超微结构趋于恢复正常（图 5）；正常对照组视网膜超微结构未图 6）。

【参考文献】