新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的构建和鉴定

发布时间：2020-10-01 17:39

　　 研究目的:时空特异性基因敲除是研究小鼠内耳基因功能的重要手段,它可以避免传统基因敲除导致的严重发育畸形和出生后死亡。但现有的内耳毛细胞基因敲除工具多为不可诱导的Cre重组酶,无法对成年小鼠内耳毛细胞基因进行高效的时间特异性敲除。为了更好地实现对成年小鼠内耳毛细胞中基因功能的研究,我们设计构建了新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠,并对其GCE重组酶的功能进行了鉴定。研究方法:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的构建主要采用了胚胎干细胞显微注射的方法,将成功转染的带有Gfi1-P2A-GFP-CreERT2目的基因片段的胚胎干细胞显微注射进E3.5天的小鼠囊胚中,通过胚胎移植的方法移植到代孕母鼠子宫,最后获得Gfi1GEC/Neo嵌合体小鼠。经过多次交配后可得到稳定遗传的Gfi1GCE/+小鼠。通过长距离PCR、免疫荧光染色、耳蜗wholemount染色及听觉脑干反应检测等方法,对Gfi1GCE/+小鼠进行了鉴定。通过对Gfi1GC/+小鼠与Rosa26tdTomato reporter小鼠交配得到的Gfi1GGCE/+;Rosa26tdTmato小鼠进行研究,鉴定了 GCE重组酶的功能并找到了实现Gfi1GC/+GCE重组酶最佳酶切效率的Tamoxifen诱导方案。研究结果:基因型鉴定LR-PCR得到的1.7kb的5'端DNA序列和1.1kb的3'端序列以及使用AcGFP引物鉴定得到的508bp的DNA序列均可证明P2A-GFP-CreERT2 DNA序列被成功插入到小鼠Gfi1第6外显子之后,确定Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功。Gfi1GCE/+小鼠中GFI1与GFP共表达,且Gfi1基因的表达和功能不受基因重组的影响,即Gfi1GCE/GCE纯合小鼠无听力下降、平衡失调等内耳发育缺陷。在GCE重组酶诱导方案方面,研究明确了对小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen 1mg/次,可实现耳蜗内外毛细胞内基因接近100%的敲除。研究结论:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功,可以实现可诱导的内耳毛细胞内基因的高效、时空特异性敲除。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;R764
【部分图文】：

４．邋２．邋２小鼠交配方法逡逑详细小鼠交配情况见图３。逡逑＾邋＾逡逑Ｇｆ＂ＣＣ￡／Ａｆｅ。小鼠邋Ｘ邋凡尸／ｆ小鼠逡逑Ｖ逦／逦Ｖ逦／逡逑ＦＩ邋ｉｐｐａｓｅ邋介导敲除Ｋｅｏ逡逑／逦Ｎ｜逦逦Ｎ逡逑Ｇｆｉｌ＾＾；邋ＦＬＰ

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，共有６个外显子组成（图５－Ａ）。由于编码Ｐ２４－的基因序列到Ｇｆｉ＿ｉ基因第６外显子的Ｃ端之后，因此Ｐ２４－ＧＦＰ－ＣｒｅＭＴ２的表达和翻译响载体基因ＣｆＨ的表达和翻译。同时Ｐ２Ａ肽链的翻译后自动断裂的特性使得ＧｆＰ－ＣｒｅＭＤ表达和翻译后的产生的蛋白质——ＧＦＰ蛋白和ＣｒｅＥＲＴ２蛋白与ＧＦ白自动分离，因此不会影响ＧＦＩ１在内耳生长发育及听觉维持中的正常功能。便质粒的筛选，／＾ｌ－ＧｆＦ－Ｃｒｅ￡７？７＾序列之后插入了一段两端带有同向ＦＲＴ序ＧＫ－Ｎｅｏ编码序列。逡逑

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本文编号：2831783