内质网应激调控晶状体上皮的生物学行为参与白内障发病机制的研究
发布时间：2020-10-10 01:29
研究目的和意义本研究拟通过一系列体内外实验,探索内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)对晶状体上皮细胞的增殖、凋亡、上皮-间质转化、胶原沉积、炎症因子表达等生物学行为和过程的影响,初步查明ERS与白内障的关系以及ERS参与白内障发生发展调控的机制。单核甘酸多态性是基因组最常见的遗传多态性形式,对金属基质蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP-2)基因 rs243865 位点的多态性检测和分析,为白内障遗传易感性与基因多态性的研究提供理论和实验数据,也可能为白内障的临床治疗提供新的手段。本研究丰富了白内障发病机制的研究,为寻找白内障潜在的生物学治疗靶点提供理论和实验支持。对候选基因的多态性分析,也可能为研发治疗药物和治疗手段提供新的思路,具有十分重要的临床意义和社会价值。方法1.将20只8日龄无特殊病原体(Specific pathogen free,SPF)级大鼠随机分为模型组和对照组,模型组大鼠按20 μ mol/kg一次性经腹腔注射亚硒酸钠溶液,隔日注射一次,连续5次,诱导建立硒性白内障大鼠模型,通过裂隙灯观察和病理检查验证造模成功。对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水,其余操作同模型组。2.体外培养人晶状体上皮细胞,随机分为ERS激活剂组、ERS抑制剂组和对照组,分别给予细胞相应的处理措施。Western Blot检测各组晶状体上皮中ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白(Glucose regulation protein-78/Binding Protein 1,GRP78/Bip)、激酶 R 样内质网激酶(Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、活化转录因子(Activating transcription factor 4,ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)的表达水平,以及与晶状体上皮-间质转化相关的蛋白如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、钙粘附蛋白E(E-cadherin)、MMP-2表达水平;MTT实验检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫组化检测晶状体上皮中ⅣV胶原沉积情况;ELISA检测炎症因子的表达。3.利用TaqMan-MGB探针对晶状体上皮-间质转化密切相关的MMP-2基因rs243865位点的多态性进行检测和分析,初步探索MMP-2基因多态性与白内障易感性的关系。结果1.用20 μ mol/kg亚硒酸钠溶液经腹腔隔日注射5次,10天即成功在模型组大鼠中诱导出硒性白内障,建模成功率100%;其中晶状体Ⅱ级浑浊2例(20%),Ⅲ级浑浊3例(30%),Ⅳ级浑浊3例(30%),Ⅴ级浑浊1例(10%),Ⅵ级浑浊1例(10%)。2.HE染色后可见模型组大鼠晶状体正常上皮和异常上皮相间分布,异常上皮可见水肿、形态和大小不一,胞质淡然疏松,有大量空泡,核多形性,细胞间隙增大;纤维粗细不均一、排列无规律,纤维之间有囊泡和水裂,可见扭曲、断裂。3.白内障大鼠晶状体组织中GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组的(3.89±0.22)倍(p0.01)、(2.97±0.09)倍(p0.01)、(2.15±0.17)倍(p0.01)和(3.11±0.19)倍(p0.01)。4.ERS激活剂组SRA01/04细胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组细胞的(1.76±0.11)倍(p0.01)、(3.62±0.17)倍(p0.01)、(3.35 ± 0.13)倍(p0.01)和(4.39±0.20)倍(p0.01);ERS 抑制剂组细胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组细胞的(0.43 ±0.05)倍(p0.01)、(0.52±0.08)倍(p0.01)、(0.32±0.06)倍(p0.01)和(0.29 ± 0.04)倍(p0.01)。5.ERS 激活剂组SRA01/04 细胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr存活率分别为(102±5)%,(108±9)%,(119±6)%,(134±5)%,(152±8)%,(168±8)%;ERS 抑制剂组 SRA01/04 细胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr 存活率分别为(102±4)%,(117 ± 7)%,(130±6)%,(162±7)%,(186±8)%,(209±8)%。ERS 激活剂处理的晶状体上皮细胞生长曲线整体在对照组下方,其中第48 hr、72 hr和96 hr的存活率与对照组有统计学差异(p0.05);ERS抑制剂处理的晶状体上皮细胞生长曲线整体在对照组上方,其中第48 hr和72 hr的存活率与对照组相比有统计学差异(p0.05)。6.ERS激活剂组SRA01/04细胞凋亡率为(15.83±1.07)%,较对照组细胞的(7.94±0.56)%显著升高(p0.01);ERS抑制剂处理的SRA01/04细胞凋亡率为(5.05±0.71)%,较对照组细胞降低(p0.05)。7.ERS激活剂组SRA01/04细胞α-SMA、E-cadherin和MMP-2蛋白表达水平分别是对照组的(2.78±0.13)倍、(0.29±0.09)倍和(1.70±0.08)倍(p均0.01);ERS 抑制剂组 SRA01/04 细胞α-SMA、E-cadherin 和 MMP-2 表达水平分别是对照组的(0.17±0.06)倍、(2.89±0.12)倍和(0.20±0.07)倍(p 均0.01)。8.ERS激活剂组SRA01/04细胞中ⅣV胶原大量沉积,平均光密度为(0.65 ±0.08),明显高于对照组的(0.23±0.03)(p0.01);ERS抑制剂处理组细胞中ⅣV胶原平均光密度为(0.11 ± 0.06),低于对照组(p0.05)。9.ERS激活剂组SRA01/04细胞IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-lα表达水平分别为(42.53±4.14)ng/ml、(6.17±2.51)ng/ml、(9.27±0.80)mg/L 和(25.22±3.28)ng/ml;ERS 抑制剂组晶状体上皮 IL-1 β、IL-6、CRP 和 TNF-1α表达水平分别为(28.52 ± 5.00)ng/ml、(3.23±2.01)ng/ml、(2.01 ±0.35)mg/L 和(11.17±2.01)ng/ml;对照组晶状体上皮 IL-1 β、IL-6、CRP和 TNF-1α表达水平分别为(30.47 ± 4.83)ng/ml、(4.41±1.74)ng/ml、(2.23±0.29)mg/L 和(15.57±3.08)ng/ml。ERS 激活剂组晶状体上皮IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-1α水平高于对照组(p0.05),ERS抑制剂组IL-6和TNF-1α水平低于对照组(p0.05)。10.白内障组CC、CT和TT 3种基因型的检测频率和期望频率分别为62%和57.01%,30%和 39.90%,12%和 7.01%;对照组 CC、CT 和 TT 3 种基因型的检测频率和期望频率分别为72%和70.04%,25%和26.20%,3%和2.40%。经Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验,两组MMP-2基因的rs243865基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(p0.05),具有可比性。11.白内障组患者MMP-2基因多态性位点rs243865的GG、GA、AA三种基因型分布人数分别是62例、30例和12例,分别占57.01%、28.85%和11.54%;对照组MMP-2基因多态性位点rs243865的GG、GA、AA三种基因型分布人数分别是72例、25例和3例,分别占72%、25%和3%。三种基因型在两组分布有统计学差异(p0.05)。12.白内障组患者C和T等位基因分布频率分别为74.04%和25.96%,对照组C和T等位基因分布频率分别为84.50%和15.50%,C/T等位基因在两组的分布频率有差异(p0.05)。13.对MMP-2基因rs243865的遗传模型分析,白内障组和对照组在加性模型下存在差异(p0.05),但隐性模型和显性模型均无显著差异(p0.05)。结论1.白内障大鼠晶状体组织中存在过度激活的ERS反应,ERS相关蛋白表达水平较正常大鼠明显升高;2.过度激活的ERS能抑制晶状体上皮细胞的增殖、促进细胞凋亡、上皮-间质转化、胶原沉积和炎症反应等生物学行为和过程,对白内障的发生发展有促进作用。3.MMP-2基因的rs243865位点多态性与人类白内障易感性相关。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R776.1
【部分图文】：
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本文编号：2834516
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R776.1
【部分图文】：
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