PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干细胞EMT的研究

发布时间：2020-10-10 02:25

　　 鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见恶性肿瘤之一,有“广东瘤”之称。复发和转移成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。肿瘤干细胞被认为是肿瘤增殖、转移和复发的根源。端粒酶在包括鼻咽癌在内的大多数肿瘤中高表达。PinX1为主要的端粒酶抑制剂。上皮间充质转化(EMT)为肿瘤转移常见的生物学过程。目前对于鼻咽癌肿瘤干细胞、端粒酶与EMT的作用关系尚不清楚。因而采用端粒酶抑制剂靶向调控端粒酶活性以抑制肿瘤干细胞及EMT的表达具有重要意义。一、CD133+鼻咽癌干细胞的分选及生物学特性目的:探究以CD133作为干细胞标志物,分选CD133+细胞并探究其生物学特性方法:磁珠分选将鼻咽癌CNE2细胞分选为CD133+和CD133-细胞,流式细胞术及荧光免疫对分选的效率进行验证,体外成球、CCK-8以及Transwell法检测细胞的体外成球、细胞增殖、侵袭、迁移能力。结果:1.以未加标志物的CNE2细胞为对照,对磁珠分选后的细胞进行流式及荧光免疫检测,结果显示CD133+细胞分选成功。2.将分选的细胞体外诱导成球培养,10天后CD133+细胞形成的肿瘤细胞球半径明显大于CD133-细胞,且成球个数更多。3.CD133+细胞的增殖速度、迁移、侵袭能力明显高于CD133-细胞。结论:鼻咽癌CNE2细胞磁珠分选成功分获得CD133+鼻咽癌肿瘤干细胞,CD133+鼻咽癌干细胞的体外成球、增殖、迁移、侵袭能力等肿瘤干细胞特征明显强于CD133-鼻咽癌细胞。二、PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干细胞EMT的研究目的:探讨PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌干细胞生物学特性及其EMT的影响方法:通过QPCR及Western blot方法检测在CD133+/-细胞中EMT的表达;并在CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒及空载质粒后端粒酶的活性,并将转染获得的细胞进行干细胞诱导成球,CCK-8法观察细胞增殖情况,Transwell检测细胞的侵袭、迁移情况,QPCR及Western blot法检测鼻咽癌肿瘤干细胞的EMT标志物、转录调控因子的表达。结果:1.对鼻咽癌EMT标志物的表达进行检测,CD133+鼻咽癌干细胞上皮化标志物E-cadherin明显低于CD133-细胞,间充质标志物Vimentin明显高于CD133-细胞。2.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,端粒酶活性明显被抑制,在干细胞生物学特性方面,细胞的成球能力明显减弱,干细胞球半径和成球个数明显减少;细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显低于空载质粒组。3.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,E-cadherin表达明显高于空载质粒组,Vimentin表达明显低于空载质粒组;EMT转录调控因子Snai1、Twist和Zeb1的表达明显低于空载质粒组。结论:1、CD133+鼻咽癌干细胞较CD133-鼻咽癌细胞表现出更强的EMT潜能;2、PinX1基因能够抑制CD133+鼻咽癌干细胞的端粒酶活性,从而抑制鼻咽癌干细胞的生物学特性并对其表现出的EMT潜力产生抑制作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.63
【部分图文】：

９４］，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９２，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９４，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９５邋和邋ＰｉｎＸｌ－Ｒ２９７邋对亲水相互作用逡逑至关重要［９３］（图１，下排）。ＰｉｎＸｌ可能与细胞核和核质中的ＴＲＦ丨相互作用，逡逑迫使内源性ＴＲＦ１在核仁中积累，增加ＴＲＦ１的端粒结合，并通过抑制其降解和逡逑泛素化来增强ＴＲＦ１的稳定性［８６］。ＴＲＦｌ－ＰｉｎＸｌ相互作用不仅需要将ＰｉｎＸｌ靶向逡逑端粒，还需要针对ＰｉｎＸｌ以防止细胞中的端粒延伸。此外，ＰｉｎＸｌ可通过与组装逡逑的ＴＥＲＴ－ＴＲ复合物结合来抑制端粒酶活性。逡逑另一方面，调节染色体稳定性是ＰｉｎＸｌ的另一个重要功能。通过基因敲除逡逑减少ＰｉｎＸｌ不仅会增加端粒酶活性和端粒长度，还会导致细胞模型中的染色体逡逑８逡逑

逦ｑ逦ＣＤ１３３邋Ａ逡逑图１－１邋ＣＮＥ２细胞在分选后，流式分选鉴定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｓｏｒｔｉｎｇ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｏｒｔｉｎｇ逡逑３．２免疫荧光检测ＣＤ１３３＋鼻咽癌细胞逡逑在无血清中培养３天后对分选后ＣＮＥ２细胞免疫荧光检测：ＦＩＴＣ标记ＣＤ１３３逡逑抗体呈绿色荧光如图１－２－Ａ，ＤＡＰＩ核染呈蓝色荧光如图１－２－Ｂ，通过融合处理Ａ逡逑和Ｂ后，表达ＣＤ１３３占存活细胞中较大比例见图１－２－Ｃ，说明在接下来的培养中，逡逑我们的细胞依旧保持着较高的ＣＤ１３３表达率。逡逑＾＾１邋ｍｉ逡逑Ａ邋ＣＤ１３３＋逦Ｂ邋ＤＡＰＩ逦Ｃ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑图１－２邋ＣＮＥ２细胞的免疫荧光检测逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．３邋ＣＤ１３３＋与ＣＤ１３３－细胞成球能力逡逑干细胞在含有生长因子的无血清培养基中进行培养，肿瘤千细胞的重要特点逡逑是可以形成千细胞球。为了检测分选出的ＣＤ１３３＋细胞是否具有成球能力，将新逡逑２２逡逑

３．２免疫荧光检测ＣＤ１３３＋鼻咽癌细胞逡逑在无血清中培养３天后对分选后ＣＮＥ２细胞免疫荧光检测：ＦＩＴＣ标记ＣＤ１３３逡逑抗体呈绿色荧光如图１－２－Ａ，ＤＡＰＩ核染呈蓝色荧光如图１－２－Ｂ，通过融合处理Ａ逡逑和Ｂ后，表达ＣＤ１３３占存活细胞中较大比例见图１－２－Ｃ，说明在接下来的培养中，逡逑我们的细胞依旧保持着较高的ＣＤ１３３表达率。逡逑＾＾１邋ｍｉ逡逑Ａ邋ＣＤ１３３＋逦Ｂ邋ＤＡＰＩ逦Ｃ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑图１－２邋ＣＮＥ２细胞的免疫荧光检测逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．３邋ＣＤ１３３＋与ＣＤ１３３－细胞成球能力逡逑干细胞在含有生长因子的无血清培养基中进行培养，肿瘤千细胞的重要特点逡逑是可以形成千细胞球。为了检测分选出的ＣＤ１３３＋细胞是否具有成球能力，将新逡逑２２逡逑

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本文编号：2834580