玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠视网膜功能影响的实验研究

发布时间：2020-10-10 12:26

　　 目的探讨玻璃体腔注射人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)体外诱导的神经干细胞(neuronal stem cells,NSCs)及抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体ranibizumab对糖尿病大鼠视网膜功能和形态结构的影响,比较两种注射药物的疗效差异,探讨h UCMSCs体外诱导的NSCs治疗糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的可能机制,为早期防治DR新的方案的提出提供理论依据。方法实验选用健康成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠63只,按随机数字表法随机分为正常对照组(A组,13只)及糖尿病造模组(50只)。糖尿病组经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病模型,正常对照组大鼠腹腔注射等容量0.1mol/L枸橼酸缓冲液。建模4、10周时,进行闪光视网膜电图(flash electroretinogram,F-ERG)国际标准暗适应视杆细胞反应(rodresponse,Rod-R)、暗适应最大反应(maximum response,Max-R)及暗适应震荡电位(oscillatory potentials,OPs)三项基本反应的检测,每只眼记录3次取平均值,苏木素伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后,光学显微镜下观察不同造模时间点视网膜形态结构的变化。证实模型成功后,将糖尿病组大鼠按随机数字表法随机分为糖尿病对照组(B组),玻璃体腔内注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)组(C组),h UCMSCs体外诱导的NSCs组(D组),ranibizumab组(E组),每组各9只大鼠,A、B组不进行干预。实验前、干预后2、4、6周分别记录各组大鼠F-ERG国际标准三项暗适应基本反应,每只眼记录3次取平均值,干预后2、4、6周光学显微镜下观察不同处理时间点视网膜形态结构的变化。采用SPSS20.0统计软件,进行统计学分析。结果1.F-ERG对造模前后糖尿病大鼠视网膜功能变化的检测:各组大鼠实验前暗适应Rod-R的b波潜伏期及振幅、暗适应Max-R的a、b波潜伏期及振幅及暗适应OPs总振幅值差异均无统计学意义(P0.05)。造模后4周,A组与糖尿病组比较仅OPs总振幅差异具有统计学意义(P0.05)。造模后10周,A组与糖尿病造模组比较,Max-R的b波潜伏期、振幅及OPs的总振幅差异均有统计学意义(P均0.05);造模成功分组后A组与B、C、D、E组比较,Max-R的b波潜伏期、振幅及OPs的总振幅差异均有统计学意义(P均0.05);而B、C、D、E组间F-ERG各波比较差异均无统计学意义(P均0.05)。2.F-ERG对干预后各组大鼠视网膜功能变化的检测:干预后2、4周,D、E组Rod、Max-R的b波振幅及OPs总振幅较B、C组显著性增加(P均0.05),Max-R的b波潜伏期较B、C组显著性下降(P均0.05);D、E组间,仅OPs总振幅差异有统计学意义(P均0.05)。干预后6周,D组Rod、Max-R的a波、b波振幅及OPs总振幅较B、C、E组显著性增加(P均0.05),Rod、Max-R的b波潜伏期较B、C、E组显著性下降(P均0.05),且随着时间延长上述指标均逐渐趋向正常;而E组与B、C组相比,F-ERG各反应指标差异均无统计学意义(P均0.05)。分别对5个实验组干预前、干预后2、4、6周4个时间进行组内比较,A组4个时间点各反应波比较差异无统计学意义(P0.05)。B、C组仅OPs总振幅差异具有统计学意义(P0.05),且均随着时间的推移OPs总振幅呈下降趋势。D组Max-R的b波潜伏期、振幅及OPs总振幅4个时间点间差异具有统计学意义(P0.05),Max-R的b波潜伏期随着时间的推移呈下降趋势,而b波振幅及OPs总振幅呈升高趋势。E组Rod-R的b波振幅、Max-R的a波振幅、Max-R的b波振幅、OPs总振幅4个时间点有显著性差异(P0.05),且随着时间的推移4个指标均呈先上升后下降的趋势。3.HE染色:造模后4周,A组和糖尿病组比较,视网膜各层组织结构未见明显差异;造模后10周,A组视网膜各层细胞排列整齐,细胞内界膜(internal limiting membrane,ILM)完整清晰,而糖尿病组视网膜各层细胞数量减少且排布紊乱;干预后2周,A组视网膜各层细胞镜下排布整齐,细胞ILM完整清晰;B、C组较A组视网膜各层细胞数量减少且排布紊乱,ILM连续性破坏并出现局部增厚的现象;D、E组和B、C组组织结构无明显差异。4周时,B、C组视网膜较2周时各层细胞更加不规则,数量逐渐减少,ILM的连续性进一步破坏、局部增厚的范围也加大,甚至可见视网膜血管内皮细胞的增殖;D、E组各层细胞排列同样不规则,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cel,RGCs)的数量较B、C组增多,血管扩张情况不明显。6周时,B、C、E组较D组RGCs数量减少,细胞核深染,神经纤维层(Nerve fiber layer,NFL)变薄且水肿明显;内核层(inner nuclear layer,INL)变薄且结构紊乱;外核层(outer nuclear layer,ONL)排列较乱,ILM完整性破坏更加严重。结论1.玻璃体腔注射h UCMSCs体外诱导的NSCs及ranibizumab对糖尿病大鼠视网膜功能均有改善作用,其中玻璃体腔注射h UCMSCs体外诱导的NSCs效果更佳。2.早期DR引起RGCs、周细胞等各层细胞的调亡要晚于视网膜功能的变化,干预后视网膜形态结构的改善晚于视网膜功能的改善。3.早期DR对F-ERG的b波反应的影响大于对a波反应的影响,振幅对视网膜功能变化的敏感度大于潜伏期。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R587.2;R774.1
【部分图文】：

图 1 大鼠 F-ERG 检测电极放置 图 2 大鼠 F-ERG 检测图2.4 玻璃体腔注射F-ERG 证实 DR 模型建立成功后，采用高压蒸汽法对微量进样器（10μl，如图 3）灭菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的剂量腹腔注射，麻醉满意后，滴加复方托吡卡胺给予散瞳并使用爱尔卡因滴眼液对大鼠眼球麻醉。微量注射器缓慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 体外诱导的 NSCs 2μl，避免吸入空气。在手术显微镜下逐渐将微量进样器针头通过巩膜，于大鼠颞侧角膜缘后 2mm 穿过睫状体平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃体腔内，避免刺伤晶状体（图 4），缓慢推注hUCMSCs 体外诱导的 NSCs，推注完成后为防止液体返流，需在拔针前停顿约15 秒，并用棉签轻压进针点 1 分钟，以防注射液返流。操作完成后，需红霉素及迪可罗眼膏涂抹于结膜囊。C、E 组大鼠使用同样的方法分别注射 0.1M PBS 和 10 mg/ml 的 ranibizuma2μl。连续 3 天观察操作后大鼠眼部状况，并用红霉素眼膏、迪可罗眼膏点眼。发生玻璃体积血者不纳为实验对象。

8图 1 大鼠 F-ERG 检测电极放置 图 2 大鼠 F-ERG 检测图2.4 玻璃体腔注射F-ERG 证实 DR 模型建立成功后，采用高压蒸汽法对微量进样器（10μl，如图 3）灭菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的剂量腹腔注射，麻醉满意后，滴加复方托吡卡胺给予散瞳并使用爱尔卡因滴眼液对大鼠眼球麻醉。微量注射器缓慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 体外诱导的 NSCs 2μl，避免吸入空气。在手术显微镜下逐渐将微量进样器针头通过巩膜，于大鼠颞侧角膜缘后 2mm 穿过睫状体平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃体腔内，避免刺伤晶状体（图 4），缓慢推注hUCMSCs 体外诱导的 NSCs，推注完成后为防止液体返流，需在拔针前停顿约15 秒

图 1 大鼠 F-ERG 检测电极放置 图 2 大鼠 F-ERG 检测图2.4 玻璃体腔注射F-ERG 证实 DR 模型建立成功后，采用高压蒸汽法对微量进样器（10μl，如图 3）灭菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的剂量腹腔注射，麻醉满意后，滴加复方托吡卡胺给予散瞳并使用爱尔卡因滴眼液对大鼠眼球麻醉。微量注射器缓慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 体外诱导的 NSCs 2μl，避免吸入空气。在手术显微镜下逐渐将微量进样器针头通过巩膜，于大鼠颞侧角膜缘后 2mm 穿过睫状体平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃体腔内，避免刺伤晶状体（图 4），缓慢推注hUCMSCs 体外诱导的 NSCs，推注完成后为防止液体返流，需在拔针前停顿约15 秒，并用棉签轻压进针点 1 分钟，以防注射液返流。操作完成后，需红霉素及迪可罗眼膏涂抹于结膜囊。C、E 组大鼠使用同样的方法分别注射 0.1M PBS 和 10 mg/ml 的 ranibizumab2μl。连续 3 天观察操作后大鼠眼部状况，并用红霉素眼膏、迪可罗眼膏点眼。发生玻璃体积血者不纳为实验对象。
【共引文献】

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本文编号：2835191