年龄相关性黄斑变性中氧化应激对KLF4及IL17RA的调控

发布时间：2020-10-22 13:55

　　 氧化应激过程中积累大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)对细胞结构造成破坏,继而导致细胞变性。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是位于视网膜感光细胞和脉络膜血管之间的单层色素上皮细胞。RPE的主要生理功能之一是吞噬和降解脱落的感光细胞外节盘,这一过程易造成细胞内ROS的大量积累。已有研究揭示,氧化应激能够促进炎症反应的发生发展。氧化应激和炎症反应引起RPE细胞变性,是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)这一主要致盲眼病的主要由诱因。白介素17(Interleukin-17,IL17)是一条关键的促进炎症信号通路。以往研究表明,IL17的受体IL17RC在AMD病人中高表达,并且IL17信号通路的激活促进RPE损伤和AMD发生。然而,IL17信号通路在氧化应激中的调控机制目前未知。本文通过葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)处理RPE人永生化细胞系ARPE-19,碘酸钠腹腔注射小鼠,构建体内、体外RPE细胞氧化应激模型,对氧化应激在RPE细胞中如何促进炎症反应进行了初步研究。经过实验,我们得出以下结论:(1)IL17RA在氧化应激的RPE细胞中表达上调;(2)IL17RA在氧化应激的RPE细胞中上调下游促炎细胞因子;(3)IL17RA启动子在氧化应激的RPE细胞中与转录因子KLF4的结合增强;(4)氧化应激的RPE细胞KLF4蛋白表达上调。本文初步揭示了在RPE细胞中氧化应激促进炎症反应的分子机制,证实在氧化应激条件下RPE细胞中KLF4对IL17RA的激活作用,为RPE细胞变性相关的眼病例如AMD的治疗,提供了参考数据。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R774.5
【部分图文】：

第三章 实验结果1.体外氧化应激模型中 RPE 细胞 IL17RA 表达量升高为研究RPE细胞中氧化应激反应对炎症反应的影响，本文利用永生化的细胞系 ARPE-19 以及 RPE1 细胞构建了体外氧化应激模型。常用的体外氧化激模型通常使用过氧化氢（H2O2）加入无血清培养基培养细胞，由于向培养细单次加入 H2O2会迅速释放殆尽，而葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GO）能在氧条件下，特异性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸以及 H2O2。本文采用向无血培养基中加入 GO，能够在药物处理过程中稳定释放 H2O2，以此构建 RPE 细体外氧化应激模型。本文为探究氧化应激条件下 RPE 细胞 IL17RA 蛋白水平的变化，以 AR细胞和 RPE1 细胞为材料，设计了 GO 处理的药物浓度梯度以及处理时间梯度验。以不同浓度的 GO 无血清培养基处理细胞 3 h，10 mU/ml 的 GO 无血清培基处理细胞不同的时长。收取细胞提蛋白，进行蛋白质印迹法（western blotWB）实验，结果分别见图 1-1 及图 1-2。

分析图1-2所示WB结果，RPE1细胞在经受GO处理后，与未经处理的RPE1细胞相较，IL17RA 条带所示信号同样出现清晰可见的增强。结合条带灰度分析所得柱状图，经 GO 处理的 RPE1 细胞表达了更多的 IL17RA 蛋白。并且，呈现出与 ARPE 细胞相似的处理时间依赖性与剂量依赖性。由此可以证实，在氧化应激条件下，RPE1 细胞中的 IL17RA 在蛋白水平的表达显著增加。根据两种 RPE 细胞 GO 处理的 WB 结果，表明 RPE 细胞经不同浓度和不同时间的 GO 处理，IL17RA 在蛋白水平的表达均升高。为了求证在氧化应激条件下的 RPE 细胞中，IL17RA 转录水平的表达是否发生变化。使用 10 mU/ml 浓度的 GO 无血清培养基处理 ARPE-19 以及 RPE1 细胞，Fig.1-2 WB analysis expression of IL17RAproteins treat by GO in RPE1 cells.设置 GO 浓度梯度：0、10 mU/ml、50 mU/ml 和 100 mU/ml，分别处理 RPE1 细胞 3 h。设置处理时间梯度：0 h、1 h、2 h 和 3 h，用 10 mU/ml GO 分别处理 RPE1 细胞相应时间。提取蛋白，进行 Western Blot，检测 IL17RA 的表达，灰度分析条带并制成柱状图。ARPE cells were treated with GO from 0-100 mU/ml or 0-3 hour as indicated. Fordose-dependent experiments, the treatment time was 3 h. For time-dependence experiment,thetreatment concentration was 10mU/ml. Right panelsshow the quantification of the relative levelof IL17RA protein based on the left immunoblot.

-3 的 qPCR 结果显示，对比未经药物处理的对照组（Control，在 GO 处理造成氧化应激（OS）的 ARPE-19 及 RPE1 细胞中的转对照组的 2-3 倍。qPCR 的结果证实，在氧化应激条件下 RPE 细的转录水平表达显著上升。图 1-1、图 1-2 和图 1-3 的实验结果表明，在 RPE 细胞的体外氧IL17RA 在转录水平及蛋白水平的表达均有显著升高。化应激模型中 RPE 细胞 IL17RA 表达量升高已通过体外试验，证实在 RPE 细胞中氧化应激引起 IL17RA 表构建体外氧化应激模型，以确定体内RPE细胞氧化应激是否改变本文所在实验室已发表论文中，已有利用碘酸钠（NaIO3，SI）建体内氧化应激模型[28]，而 NaIO3是一种主要靶向 RPE 细胞的。本文依旧采用 NaIO3作为注射药物，考虑到眼窝注射对操作者图 1-3 qRT-PCR 检测氧化应激下 RPE 细胞中 IL17RA 的转录活性-3 qRT-PCR analysis to detection IL17RAexpression with GO treatment (10 n ARPE and RPE1 cells.
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本文编号：2851684