下咽癌组织和循环miRNA表达谱及miR-4451、miR-200a-3p在预后和脂代谢调控中作用的研究

发布时间：2020-11-05 12:01

　　 背景下咽癌是一类原发于下咽部的恶性肿瘤,病理类型以鳞状细胞癌为主。其发生与过量酗酒以及吸烟有密切关联。下咽癌是头颈外科手术中处理最为棘手的一种肿瘤。其早期没有特异性症状,一旦发现多为进展期肿瘤。下咽癌易影响上消化呼吸道的生理功能,组织学上缺乏天然的生物学屏障,淋巴引流丰富,容易发生重复癌,这导致下咽癌治疗难度大,容易复发,是头颈鳞癌中治疗难度较大的一种类型。尽管目前对下咽癌的治疗已经形成了手术加放化疗综合治疗的共识,治疗手段己经有极大丰富,下咽癌的整体治疗效果仍然不容乐观。局部复发和远处转移仍然是下咽治疗所面临的挑战。肿瘤的个体化治疗是当前肿瘤诊治的方向。针对患者的自身情况为患者的设计个性化的治疗及随访方案是肿瘤诊治的原则。对肿瘤的复发及早诊断能够提高治疗的有效性,改善预后。除了传统的TNM分期系统外,许多分子肿瘤标记物被应用于下咽癌的预后诊断,提高了对下咽癌随访的效果并增加了对肿瘤生物学的认识。蛋白与基因等目前作为分子标记物的弊端是其容易受到环境中理化因素的影响,酶类,湿度及温度等诸多因素都可能导致降解或变质,干扰表达。对于临床上常见的储存标本如血制品和石蜡切片等,这些分子的检出难度较大。miRNA是一种体内合成的小分子RNA,人体的发育调节,免疫功,各器官疾病以及肿瘤的发生,发展和转归均有miRNA的参与。miRNA分布广泛,在组织、血浆甚至体液中均有表达。其表达相当稳定,可以在石蜡组织中长期稳定的表达,是一种理想的分子标记物。目前对miRNA在下咽癌预后中的研究缺乏大样本数据的支持,本研究目的在于通过高通量技术筛选并结合生存分析模型,在一个大样本下咽癌病例中筛选与下咽癌预后相关的miRNA,评估其临床价值。在体外细胞实验中验证其生物功能,并通过预测寻找其靶基因,探索其调控机制,为下咽癌的防控和分子生物研究提供新方向。第一部分下咽癌组织和循环miRNA表达谱及miR-4451和miR-200a-3p与下咽癌预后相关性的研究目的通过芯片技术和qPCR筛选下咽癌组织和循环中差异表达的miRNA,结合生存分析筛选与下咽癌预后相关的miRNA,并评估其临床价值。方法回顾我科2011年1月至2016年1月间的下咽癌患者分为两组,统计患者的临床和流行病学资料。对2015年7月至2016年1月之间的患者纳入下咽癌表达验证组,收集采集患者的肿瘤组织,粘膜组织和血浆标本,用于验证miRNA在肿瘤组织和血浆中的表达。对2011年1月至2015年6月之间的患者纳入下咽癌生存分析组,收集患者的的病理切片,并对患者进行生存随访,以验证miRNA与下咽癌预后的相关性。另收集健康对照者血浆标本。提取组织中的miRNA,应用Agilent miRNA芯片(ID:070156)高通量的筛选候选miRNA。本研究采用了两种筛选策略,(1)以肿瘤和粘膜分组,在下咽癌肿瘤组和粘膜组之间通过芯片筛选差异表达的miRNA;(2)以中位生存期分组,在下咽癌长期生存组和短期生存组的肿瘤组织之间通过芯片筛选差异表达的miRNA。对筛选出的miRNA,在表达验证组的40对下咽癌肿瘤和粘膜组织中,通过qPCR检测其表达水平,以检验其在下咽癌中差异表达。在血浆中通过qPCR检测miRNA表达水平,研究其与组织表达水平的相关性,并通过对比正常志愿者的血浆miRNA表达水平,评估及临床价值。对经验证在下咽癌组织中存在差异表达的miRNA,通过qPCR的方法,在生存分析组患者的肿瘤切片中检测其表达水平。通过Kaplan-Meier生存分析,采用Log-rank检验不同miRNA表达组之间生存时间的差异。结合患者临床和流行病学资料,通过Cox比例风险模型研究预后相关miRNA的风险比和多因素调整后的风险比,并分析预后相关miRNA与患者临床和流行病学特征的相关性。通过Harrel's c-index评估包含预后miRNA在内多个协变量的Cox模型的诊断预测能力,研究miRNA对于预后的临床价值。并尝试通过构建miRNA预后指数,充分发挥miRNA对下咽癌预后诊断的能力。结果在下咽癌肿瘤组和粘膜组之间,芯片筛选出11个差异表达的miRNA,其中肿瘤组中高表达的有let-7c-5p,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451a和miR-497-5p,低表达的有miR-106b-5p,miR-3195,miR-424-5p,miR-4443和miR-93-5p。在下咽癌长期生存组和短期生存组的肿瘤组织之间,芯片筛选14个差异表达的miRNA,其中短期生存组中高表达的有miR-4451,miR-3605-5p,miR-3161,miR-30b-5p,miR-200a-3p,miR-7150,miR-378b和miR-5088-5p,低表达的有miR-200c-3p,miR-429,miR-4688,miR-4701,miR-6808-5p和miR-6813-3p。在40对下咽癌肿瘤和粘膜组织qPCR验证以上候选miRNA,9个miRNA表达有统计学差异。在下咽癌肿瘤组织中低表达的有miR-126-3p(FC=0.55),miR-195-5p(FC=0.0.71),miR-29c-3p(FC=0.63),miR-451a(FC=0.28)和miR-497-5p(FC=0.49),高表达的有 miR-106b-5p(FC=1.67),miR-93-5p(FC=1.85),miR-4451(FC=1.91)和miR-200a-3p(FC=1.36)。以上差异表达的miRNA中只有miR-93-5p的血浆表达水平于组织表达相关,Spearman相关系数为0.516,且其表达水平高于健康对照者。ROC检验显示AUG为0.701(p=0.002),在cut-off值0.143处敏感度为0.625,特异度为0.628,约登指数为0.997。本研究同时证实,RNU48是下咽癌相关实验合适的内参基因。qPCR检测上述9个差异表达miRNA在生存分析组372例下咽癌患者肿瘤组织中的含量。Log-rank检验显示miR-4451和miR-200a-3p表达水平与预后相关,miR-200a-3p低表达组预期生存期64.8月(95%CI:59.4-70.1),高表达组预期生存期52.8个月(95%CI:46.8-58.7),miR-4451低表达组的预期生存期65.6个月(95%CI:30.2-71.0),高表达组的生存期52.2个月(95%CI:46.3-58.1)统计学差异均显著。miR-200a-3p和miR-4451高表达组预后不佳。单因素Cox 比例风险模型显示结果显示,miR-200a-3p高表达组相对低表达组的风险比为1.51(95%CI:1.09-2.09),而miR-4451高表达组相对低表达组的风险比为1.64(95%CI:1.18-2.28)。将T分期,N分期,病理分级和原发部位作为协变量做多因素Cox分析,以上风险比被调整为1.42(95%CI:1.02-1.98)和1.47(95%CI:1.06-2.06),统计学差异均显著。T4期患者中miR-200a-3p高表达和miR-4451高表达的比例显著增加,N2和N3期患者中miR-200a-3p高表达比例增加。以miR-4451和miR-200a-3p表达水平构建预后指数显示,两者共同高表达使患者风险比增加至1.67(单因素,95%CI:1.19-2.33),1.56(多因素,95%CI:1.11-2.20)。Harrel's C-index显示Cox模型加入miR-4451和miR-200a-3p后诊断预测能力有所增加。结论及意义下咽癌肿瘤组织中,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451 a和miR-497-5p低表达,miR-106b-5p,miR-93-5p,miR-4451和miR-200a-3p高表达。下咽癌患者血浆中miR-93-5p高表达,可作为诊断指标。miR-200a-3p高表达和miR-4451高表达与下咽癌患者预后不佳有关。该研究为下咽癌预后的分子诊断提供了新的方向。第二部分miR-4451靶向ABHD5调控下咽癌FaDu细胞生物学行为和脂代谢的研究目的通过细胞实验验证第一部分筛选出的miR-4451和miR-200a-3p对下咽癌FaDu细胞系生物学行为的影响,进一步寻找其下游靶基因并予以功能验证,在分子水平和细胞水平研究miRNA调控靶基因对下咽癌生物学行为的影响,阐明其功能机制。方法以FaDu细胞为研究对象,通过转染miRNA mimics和inhibitor干扰细胞内miRNA的表达水平。通过CCK8实验,Transwell迁移和侵袭实验,观察不同miRNA表达水平对下咽癌FaDu细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结合TargetScan数据库,miRWalk数据库和mRNA芯片,筛选潜在的miRNA靶基因,并通过Starbase进一步缩小靶基因预测范围。通过转染miRNA mimics干扰miRNA细胞内表达水平,结合qPCR和Western blot方法从mRNA和蛋白水平检测候选靶基因的表达的改变,进一步筛选靶基因。构建pmirGLO靶基因3'UTR质粒,与mimics共转染Fadu细胞,以双荧光素酶报告基因实验验证靶基因。对于筛选的靶基因,在表达验证组40对下咽癌肿瘤和粘膜组织中通过qPCR检测其miRNA水平,研究靶基因与下咽癌表达的相关性。在生存分析组的患者中取其中57例患者肿瘤切片行免疫组化染色,半定量检测其蛋白表达水平,结合患者生存数据研究其与下咽癌预后的相关性。对下咽癌FaDu细胞转染靶基因siRNA干扰其表达,通过CCK8实验,Transwell迁移和侵袭实验,观干扰察靶基因对下咽癌FaDu细胞增殖、迁移和侵袭的影响。对miRNA的功能做回复实验,共转染miRNA inhibitor和靶基因siRNA研究其交互作用对FaDu细胞迁移和脂代谢的影响。结果功能实验表明miR-4451促进下咽癌FaDu细胞的增殖、迁移和侵袭,而miR-200a-3p对下咽癌FaDu细胞增殖无作用。通过生信数据库和miRNA芯片,共筛选ABHD5,SLC37A2和ZNF527为候选靶基因。转染miR-4451 mimics后ABHD5在mRNA和蛋白水平均有低表达。双荧光素酶报告基因实验发现共转染pmirGLO-ABHDwild type和miR-4451mimics,FL/RL显著下降,证实ABHD5为miR-4451 的靶基因。qPCR检测表达验证组40对组织显示,肿瘤组织中ABHD5的mRNA表达水平降低。免疫组化染色结果结合生存分析显示在2012年至2013年的57例下咽癌患者中,低表达ABHD5预后差,预期生存期低表达组vs高表达组为41.7月vs 64.8月。转染AHBD5 siRNA可促进促进下咽癌FaDu细胞的增殖、迁移和侵袭。miRNA功能回复实验表明,转染ABHD5 siRNA可回复miR-445 1inhibitor对细胞增殖和脂代谢的影响。miR-4451靶向ABHD5促进FaDu细胞迁移作用,同时伴有肿瘤细胞脂滴含量增加。结论及意义miR-4451促进下咽癌FaDu细胞的增殖,迁移和侵袭。miR-4451通过靶向调控ABHD5影响FaDu细胞脂代谢和生物学行为。ABHD5在下咽癌组织中低表达,与下咽癌预后有关,ABHD5可促进下咽癌FaDu细胞的增殖,迁移和侵袭。该部分研究为深入了解下咽癌生物学行为和脂代谢异常提供了新的方向。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.63
【部分图文】：

图１－１下咽癌肿瘤和粘膜差异表达ｍｉＲＮＡ芯片（芯片１）的原Ａ：１０４Ｔ，?Ｂ：１０４Ｍ，?Ｃ：１０５Ｔ，?Ｄ：?１０５Ｍ，?Ｅ：１０７Ｔ?，?Ｆ：１０７Ｍ，?Ｇ：１１

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图１－６血浆ｍｉＲ－９３－５ｐ表达的研宄，Ａ：下咽癌患者血浆的ｍｉＲ－９３－５ｐ表高于正常对照者，Ｂ：血浆ｍｉＲ－９３－５ｐ诊断的ＲＯＣ分析。（＊为统计学差异４??
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1 徐新博;下咽癌组织和循环miRNA表达谱及miR-4451、miR-200a-3p在预后和脂代谢调控中作用的研究[D];山东大学;2019年

本文编号：2871612