机械性压力刺激对人眼角膜成纤维细胞影响的研究

发布时间：2020-11-13 19:18

　　 目的:分离、培养并鉴定飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(Small incision lenticule extraction,SMILE)来源人眼角膜成纤维细胞。探究体外机械性压力(Mechanical compression)不同加载强度及加载时间对人眼角膜成纤维细胞的细胞形态、增殖与凋亡、基质合成与降解等生命活动中相关分子表达水平的影响。方法:SMILE手术获取人角膜基质透镜,I型胶原酶(Collagenase I)消化、体外分离培养人眼角膜成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光染色检测细胞波形蛋白(Vimentin)表达以鉴定细胞类型。建立体外细胞机械性压力刺激模型,对人眼角膜成纤维细胞给予不同压力梯度(Agar+0g、Agar+1g、Agar+2g、Agar+4g、Agar+8g、Agar+16g、Agar+24g、Agar+32g),不同加载时长(6h、24h、48h)的机械性压力刺激。倒置显微镜观察人眼角膜成纤维细胞在不同机械性压力刺激下形态学的变化。免疫荧光BrdU染色比较人眼角膜成纤维细胞在不同机械性压力刺激前后增殖水平的变化。免疫荧光Annexin V/PI染色比较人眼角膜成纤维细胞在不同机械性压力刺激下细胞凋亡水平的变化。qRT-PCR检测细胞基质合成和降解相关基因mRNA的表达水平,检测主要指标包括:基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)家族成员MMP1、MMP9,其拮抗蛋白基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成员TIMP1、TIMP2、TIMP3,角膜结构性蛋白相关基因α1-1型胶原(Collagen type I alpha 1 chain,Col1a1)、光蛋白聚糖(Lumican)、Vimentin等。结果:1、通过胶原酶消化法可从SMILE手术来源的角膜基质透镜组织中快速获得并培养人眼角膜成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态呈长梭形或不规则三角形,符合角膜成纤维细胞特性,免疫组织荧光染色Vimentin表达阳性,明确体外培养所获得细胞为角膜成纤维细胞,无角膜上皮细胞及角膜内皮细胞等污染。2、成功建立机械性压力刺激模型,并对人眼角膜成纤维细胞施加梯度机械性压力刺激,观察显示相对低加载强度、相对短加载时间条件下的细胞仍可维持其固有形态特征,随压力加载强度增大和加载时间延长,Agar+32g组刺激6h、Agar+16g组刺激48h、Agar+24g组刺激48h细胞出现显著形态改变,细胞形体变大,胞质突起变短变粗,细胞核变大,部分细胞内可见核固缩。3、免疫荧光BrdU染色结果显示,机械性压力加载8h后空白对照组(CON组)与Agar+0g组细胞的BrdU阳性细胞比例无显著差异,Agar+8g组细胞的BrdU阳性细胞比例较CON组显著降低,说明机械性压力刺激可显著抑制人眼角膜成纤维细胞增殖。免疫荧光Annexin V/PI染色结果显示,机械性压力加载8h后Agar+8g组较CON组细胞的Annexin V染色阳性细胞比例升高,PI染色阳性细胞比例升高,说明机械性压力刺激可促进人眼角膜成纤维细胞凋亡。4、qRT-PCR检测角膜基质结构相关分子mRNA结果显示,机械性压力刺激6h时MMP1、MMP9的基因表达显著升高,TIMP1、Lumican表达轻度升高,TIMP3表达显著降低,余基因表达未见明显差异。机械性压力刺激24h时,MMP1出现随压力梯度增长表达量上调的趋势,Col1a1则出现随压力梯度增长表达量下调的相反趋势,MMP9仍在多个压力组中有明显升高,余基因表达未见明显差异。机械性压力刺激48h时,MMP1仍可见表达量上调,此外Col1a1、Vimentin、Lumican等角膜结构性蛋白mRNA表达出现显著下调,余基因表达未见明显差异,说明机械压力会对角膜基质结构产生相应影响。结论:1、通过SMILE手术来源的角膜基质透镜组织加以胶原酶消化以培养细胞,是获得充足、纯化的正常原代人眼角膜成纤维细胞的有效方式。2、对人眼角膜成纤维细胞施加梯度机械性压力刺激,随压力加载强度增大和加载时间延长,细胞将失去其固有形态特征。3、人眼角膜成纤维细胞的增殖与凋亡明显会受到机械性压力刺激的影响。4、机械性压力短时间加载可促进人眼角膜成纤维细胞基质金属蛋白酶家族成员MMP1、MMP9的表达,长时间加载可抑制角膜结构性蛋白Col1a1、Lumican、Vimentin的表达,进而参与影响人角膜基质结构重塑。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R77
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文原代培养第 1 天，倒置显微镜下观察可见角膜成纤维细胞已贴壁，约半数细胞呈长梭形，半数细胞呈圆形或椭圆形，中央有卵圆形细胞核（图 1.1-A）；原代培养第 3 天，所有细胞呈长梭型或不规则三角形，胞质突起，生长呈放射状（图 1.1-B）；原代培养第 5 天，可见细胞进一步倍增，生长密度达 90%以上，达到传代培养所需密度（图 1.1-C）。

成纤维细胞原代培养生长情况养第 1 天，细胞已贴壁，呈长梭形（黑色箭头）或椭圆形（，细胞呈长梭形或不规则三角形，放射状生长；C：原代培 90%以上。（标尺=100μm）纤维细胞免疫荧光鉴定至第 5 代，Vimentin 免疫荧光染色，胞浆中可见红色所培养的原代细胞为角膜成纤维细胞（图 1.2）。

机械性压力施加示意图；C：12 孔细胞培养板加压后实物图2.1.2.2 倒置显微镜观察记录细胞施加机械性压力前，在培养板每孔中央区域记号笔标记固定位点，倒置显微镜下观察并拍照。待细胞机械性压力刺激实验所需时长后，用无菌镊取出施重砝码、施重玻片和琼脂凝胶垫，于倒置显微镜下观察标记位置细胞形态，比较刺激前后同一位置细胞形态的变化情况。2.1.2.3 总 RNA 提取细胞观察结束后，弃去细胞培养液，PBS 缓冲液冲洗死细胞 2 次，加入 500μl/孔 Trizol 裂解细胞，回收至 1.5mlEP 管后，摇床上摇动 5min 以充分裂解细胞使核蛋白体完全分解。加入 100μl/管氯仿抽提 RNA，震荡 15s，静置 15min
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本文编号：2882533