特异性促消退介质延缓视网膜退行性疾病进展及其机制的研究

发布时间：2020-11-21 08:36

　　 研究背景视网膜退行性疾病(Retinal degeneration,RD)指包括视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)和青光眼等在内的一系列致盲性眼病。目前,RD是世界范围内不可逆盲的首位病因,也是WHO现阶段防盲重点~([1]),其共同病理生理机制是感光细胞和(或)神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGC)等神经细胞渐进性凋亡以及由此导致的视网膜感光功能丧失和视觉信号传导障碍。由于致病因素的复杂性,此类疾病目前尚缺乏有效治疗手段。不同的致病因素,如遗传突变或视网膜缺血、缺氧等损伤应激,是否能够触发相同的细胞凋亡途径?我们是否能够调控该凋亡途径?这对于治愈此类病因异质但表型相似的疾病是至关重要的。研究发现,视网膜退行性疾病的发生发展过程中感光细胞和RGC的进行性凋亡主要归因于两方面:其一是感光细胞或RGC因其自身基因突变缺陷发生凋亡反应~([2,3,4])。既往研究表明,钙调蛋白酶(calpains)在视网膜细胞因基因缺陷合成并积累异常蛋白质时被激活~([5]),且在退行性病变视网膜中依赖于calpains的细胞凋亡途径具有重要地位~([6]);其二是视网膜退行性疾病中失衡的视网膜微环境加剧了感光细胞和RGC的非细胞自主性的凋亡~([7])。如在青光眼、DR和RP的视网膜中过量谷氨酸致calpains激活并参与细胞凋亡~([8])。此外,小胶质细胞作为视网膜最主要的常驻免疫应答细胞,其在退行性病变过程中被激活并扮演双刃剑的角色。一方面,激活的小胶质细胞可以吞噬凋亡的细胞,清除炎症物质,限制炎症反应。另一方面,过度激活的小胶质细胞则会释放大量促炎因子恶化视网膜微环境~([9,10]),加剧感光细胞和RGC的凋亡。因此,抑制视网膜中依赖calpains的凋亡反应或调控小胶质细胞介导的视网膜炎症可望成为治疗视网膜退行性疾病的新策略。特异性促消退介质(Specialized pro-resolving mediators,SPM)是机体内ω-6/3多不饱和脂肪酸(ω-6/3 PUFA)代谢生成的一类具有抗炎、促炎症消退及促细胞再生的脂类介质~([11])。机体内含量最为丰富的ω-6和ω-3 PUFA分别是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)。在15-脂氧合酶(15-LOX)的作用下,DHA和AA分别代谢生成脂氧素A4(Lipoxin A4,LXA4)和神经保护素D1(Neuroprotectin D1,NPD1)。前者主要表现出较强的抗炎作用,而后者则具有较为显著的神经保护特性。既往文献表明机体内SPM的代谢失调在阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、AMD以及青光眼等神经退行性疾病中均可发生~([12,13,14]),且15-LOX参与介导DR中视网膜炎症和青光眼中RGC的保护作用~([15,16])。这提示SPM可能是治疗视网膜退行性疾病的重要调控介质。因此,我们提出假设:在视网膜退行性疾病的进展中,SPM可能具有重要调控作用。SPM一方面通过直接抑制神经细胞中calpains参与的凋亡反应保护感光细胞、RGC等神经细胞;另一方面,SPM通过调控小胶质细胞的激活,改善视网膜炎症微环境来发挥间接神经保护作用。研究目的本研究主要探索了LXA4和NPD1两种重要的SPM对于视网膜退行性疾病过程中神经细胞的凋亡及小胶质细胞的激活是否具有调控作用。研究方法第一部分:LXA4延缓视网膜变性疾病的进展1.按照RD1小鼠发育与其视网膜变性不同阶段的关系,将RD1小鼠的病程分为变性前期(PN7)、变性高峰期(PN14)和变性晚期(PN21)。利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对三阶段的RD1小鼠视网膜中LXA4受体及其代谢关键酶的mRNA表达水平进行评估;2.分别于PN6、PN9和PN12行RD1小鼠玻璃体腔注射LXA4或PBS处理,而后进行:1)运用ERG、视觉行为学实验评估RD1小鼠视功能;2)利用视网膜冰冻切片免疫荧光染色技术评估RD1小鼠感光细胞的凋亡,RT-PCR及Western blotting从分子水平上检测感光细胞特异标记物Rhodopsin的表达水平;3)利用视网膜冰冻切片免疫荧光、RT-PCR及Western blotting技术检测RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的形态及其相关炎症因子的表达水平;3.取PN13的RD1小鼠视网膜离体培养并进行LXA4处理,于PN21应用炎症因子蛋白芯片检测变性期间小胶质细胞相关炎症因子及其激活标记物CCL-2的表达水平变化。第二部分:NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC为了研究视网膜内calpains参与的细胞凋亡反应,我们采用NMDA损伤视网膜大鼠模型。首先,为了明确NPD1对NMDA损伤RGC是否具有保护作用,我们进行了:1.取出生后21天(PN21)的Long Evans(LE)大鼠随机分组后行玻璃体腔注射NMDA、NMDA+NPD1、PBS,并在其后进行视觉电生理检查、视觉行为学检查评估大鼠视功能,以及视网膜冰冻切片免疫荧光染色评估RGC凋亡;2.取PN21的LE大鼠随机分组后,分别以富含DHA饲料、缺乏DHA饲料和普通饲料喂养一个月,后行ELISA检测内源性NPD1水平是否增高。随后大鼠接受玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理,并利用视觉电生理检查、视觉行为学检查评估大鼠视功能,以及免疫荧光染色评估RGC凋亡;接下来,为了探究NPD1对NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC保护作用的机制,我们进行了:3.应用转录组测序和蛋白组检测技术分析玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理的LE大鼠视网膜中总RNA表达谱和蛋白质的变化,并用RT-PCR和Western blotting实验验证;4.取PN21的LE大鼠随机分组后行玻璃体腔注射calpain 1、calpain 1+NPD1、PBS,并在其后进行视网膜冰冻切片免疫荧光染色评估RGC凋亡;RT-PCR检测三组视网膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特异表达基因以及Bax、Bid、AIF等参与calpain 1依赖性凋亡途径的基因的表达水平;5.采用视网膜冰冻切片免疫荧光标记iba1评估玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理的LE大鼠视网膜中小胶质细胞的形态,并利用Western blotting检测小胶质细胞激活及吞噬功能相关的生物标记物CCL-2和ED-1蛋白的表达变化;RT-PCR技术检测两组视网膜组织中炎症因子表达变化。研究结果第一部分:LXA4延缓视网膜变性疾病的进展1.LXA4维持RD1小鼠视功能作用的研究(1)LXA4合成限速酶和受体在视网膜变性过程中表达水平的变化在PN14的RD1小鼠视网膜中,Alox15和Fpr2 mRNA水平较PN7显著升高(p0.0001),但与PN14相比,在RD1小鼠变性晚期(PN21)时两者的表达显著降低(p0.0001)。(2)LXA4延缓RD1小鼠视功能的丧失LXA4处理组RD1小鼠在PN15、PN18(p0.01)和PN21(p0.05)三个时间点的ERG反应中持续表现出比PBS处理组小鼠更高的b波幅值。在开放明场视觉行为学检测实验中,PN18(p0.05)和PN21(p0.01)的LXA4处理组RD1小鼠在暗室中停留的时间明显长于PBS处理组,提示LXA4维持变性晚期RD1小鼠的视功能。2.LXA4对RD1小鼠视功能维持作用的机制研究(1)LXA4减少RD1小鼠视网膜中感光细胞的凋亡免疫染色结果可见LXA4处理组RD1小鼠视网膜ONL的Rhodopsin阳性细胞数量明显高于PBS处理组。RT-PCR(p0.01)及Western blotting结果(p0.001)证实了LXA4处理的RD1小鼠视网膜中Rhodopsin表达水平更高。TUNEL染色显示LXA4显著减少感光细胞凋亡(p0.05)并维持RD1小鼠视网膜外核层厚度(p0.01)。(2)LXA4缓解RD1小鼠视网膜中的小胶质细胞激活1)LXA4缓解RD1小鼠视网膜炎症反应LXA4处理使PN21的RD1小鼠视网膜中Alox5 mRNA表达水平显著降低(p0.05)。2)LXA4调节RD1小鼠视网膜中激活小胶质细胞相关的炎症因子的表达免疫染色结果可见LXA4处理组与PBS处理组的变性晚期RD1小鼠视网膜中iba1阳性的小胶质细胞皆呈现“阿米巴”样激活状态,但Western blotting检测结果发现,LXA4处理的RD1小鼠视网膜中iba1蛋白的表达水平较PBS处理组明显降低(p0.01)。LXA4显著抑制RD1小鼠视网膜中细胞因子,如CCL-2,iNOS,TNF-α,IFN-γ,IL-1β和GM-CSF在mRNA水平的表达(p0.05),但提高了IL10 mRNA水平表达(p0.0001)。以上数据提示LXA4减少RD1小鼠视网膜中激活小胶质细胞的数量,同时降低激活小胶质细胞相关的促炎因子的表达。3)LXA4减少离体培养的RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的激活细胞因子蛋白芯片结果显示,LXA4处理组RD1小鼠视网膜及其培养上清中的所有可检测到的炎症因子与PBS处理组相比均显著降低。PN21的RD1小鼠视网膜及其培养上清中都检测到更高的CCL-2含量,且LXA4处理明显降低了PN21的RD1小鼠视网膜CCL-2的产生和分泌(p0.05),提示LXA4降低变性晚期的RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的激活。第二部分:NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC1.NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC的作用研究(1)大鼠玻璃体腔注射NPD1保护NMDA损伤的RGC1)大鼠玻璃体腔注射NPD1减少NMDA诱导的RGC凋亡大鼠玻璃体腔单独注射NMDA后RGC发生剧烈快速的凋亡反应,且这种现象在72h内较为明显。利用LE大鼠行玻璃体腔NMDA单独注射,或玻璃体腔NMDA+NPD1共注射,并在其后的24h、48h及72h时进行免疫荧光染色。结果发现,与NMDA单独注射组相比,NMDA+NPD1共注射组的大鼠视网膜中TUNEL和Brn3a双阳性细胞分别由60±4.8%降至41±6.3%(p0.05),55±7.5%降至31±4.3%(p0.01),以及50±3.7%降至27±3.1%(p0.001),提示NPD1降低NMDA诱导的RGC凋亡反应。2)大鼠玻璃体腔注射NPD1维持NMDA损伤的RGC电生理功能利用LE大鼠行玻璃体腔注射NMDA单独注射,或NMDA+NPD1共注射,并在其后的72h内行大鼠视觉电生理检查。ERG结果发现,NMDA+NPD1共注射组的大鼠的PhNR幅值从102±11μV以较平缓趋势下降至63±13μV,而NMDA单独注射组大鼠的PhNR幅值从103±14μV急剧下降至24±8μV。fVEP结果显示,NMDA+NPD1共注射较NMDA单独注射组的大鼠在24h、48h和72h皆维持较高的P_2波幅值(p0.05)。以上数据提示,NPD1维持NMDA损伤的RGC电生理功能。3)玻璃体腔注射NPD1挽救NMDA损伤视网膜大鼠模型的视敏度与PBS处理组相比,大鼠玻璃体腔单独注射NMDA 72h后,其视敏度由0.76±0.05c/d下降至0.27±0.19 c/d,但NMDA+NPD1共注射组大鼠的视敏度仅下降至0.56±0.05c/d,显著地挽救了大鼠的视功能(p0.001)。(2)内源性提高NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC1)膳食补充DHA提高大鼠内源性NPD1含量ELISA结果显示,与膳食缺乏DHA组大鼠相比,大鼠膳食补充DHA可将其视网膜组织中内源性NPD1含量由36.2±2.8提升至48.8±0.9 pg/mg(p0.001),血浆中NPD1含量则由6.0±0.03增至8.5±0.3 pg/ml(p0.001)。2)内源性提高NPD1减少NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC凋亡免疫染色显示,膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,TUNEL和Brn3a双阳性的细胞数占GCL的89.93±2.73%,而膳食富含DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,TUNEL和Brn3a双阳性的细胞数仅为21.33±2.36%(p0.001)。但膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射后,其双阳性细胞比例又可显著降低至11.58±3.13%(p0.001),提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA诱导的损伤,但内源性和外源性NPD1的升高都能减少RGC的凋亡。膳食富含DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,其PhNR幅值为44.23±4.66μV,而膳食缺乏DHA组大鼠在玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,其PhNR幅值为22.78±1.93μV,较富含DHA组明显降低(p0.05)。但膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射后,其PhNR幅值则被显著维持在43.40±2.82μV(p0.05),提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA的损伤,但内源性和外源性NPD1的升高都能维持RGC的功能。2.NPD1对NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC保护作用的机制研究(1)NPD1通过降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达减少RGC凋亡1)NPD1调控大鼠NMDA损伤视网膜中神经死亡相关通路利用转录组测序和蛋白组检测技术筛选出玻璃体腔NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组的大鼠视网膜组织中差异表达的基因和蛋白质,经功能聚类发现NPD1调控神经元死亡和发育以及炎症反应等过程。2)NPD1负调节大鼠NMDA损伤视网膜中细胞凋亡反应由转录组测序筛选出NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组的大鼠NMDA损伤视网膜组织中差异表达基因进行聚类热图分析,发现NPD1下调与细胞凋亡反应相关的基因,火山图中calpain 1在281个下调差异基因中排名位居前列。3)NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达以缓解视网膜细胞凋亡反应Western blotting及RT-PCR结果显示大鼠玻璃体内NMDA单独注射诱导其视网膜组织中calpain 1的蛋白(p0.05)和mRNA水平(p0.001)升高,且Bax,Bid,AIF和Caspase 3四个参与calpain 1依赖性凋亡途径的基因的mRNA水平皆显著升高(p0.001)。但NMDA+NPD1共注射则能够显著抑制大鼠视网膜中calpain 1蛋白(p0.05)和mRNA表达(p0.01),以及Bax,Bid,AIF和Caspase 3的mRNA表达,提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达以缓解视网膜中细胞凋亡反应。4)NPD1减少大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1诱导的RGC凋亡在NMDA损伤的大鼠视网膜中,免疫染色显示calpain 1与NeuN/Brn3a共定位,提示calpain 1表达在RGC上。利用LE大鼠上行玻璃体腔注射时,免疫染色发现,与PBS处理组相比,calpain 1单独注射组大鼠视网膜中凋亡的RGC由1.96±0.51%提高至19.08±1.58%(p0.001),但calpain 1+NPD1共注射组大鼠视网膜中RGC的凋亡仅为8.90±1.10%,明显低于calpain 1单独注射组(p0.001)。RT-PCR结果发现,与calpain1单独注射组相比,calpain 1+NPD1共注射组大鼠视网膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特异表达基因的mRNA水平较高,而Bax、Bid、AIF以及Caspase 3的mRNA水平较低。以上结果提示,NPD1减少calpain 1诱导的RGC凋亡。(2)NPD1通过调控大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞介导的炎症反应保护RGC1)NPD1调控大鼠NMDA损伤视网膜组织中炎症相关通路由转录组测序和蛋白组检测技术筛选出玻璃体腔NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组大鼠视网膜组织中差异表达的基因和蛋白质,经功能聚类发现NPD1参与调控大鼠NMDA损伤视网膜的炎症反应,差异基因热图提示NPD1下调炎症反应中的基因。2)NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中炎症因子表达水平LE大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射相较于NMDA单独注射,可以显著降低其视网膜中诸如CCL-2、IL1β、IFN-γ、TNFα等细胞因子的表达,但又上调了抗炎因子TGF-β和IL10,皆具有差异显著性(p0.001),提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中炎症因子的表达。3)NPD1缓解大鼠NMDA损伤视网膜中激活小胶质细胞介导的炎症LE大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射与NMDA单独注射,由免疫染色结果发现前者视网膜中iba1阳性的小胶质细胞在形态上呈现出更多分枝和更长突起(p0.05),由Western blotting结果发现前者视网膜中CCL-2蛋白表达水平明显降低(p0.05),而ED-1蛋白的表达水平升高至后者视网膜组织的8.5倍(p0.05),提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞的激活,并促进其吞噬清除作用,从而限制炎症反应。研究结论1.本研究揭示,在视网膜退行性疾病动物模型RD1小鼠中,SPM的代谢关键酶15-LOX的表达水平在病变早期先代偿性升高,在病变晚期则显著降低,表明内源性SPM失调可发生在视网膜退行性疾病中。这为采用SPM调控视网膜退行性疾病进展提供了新的思路。2.本研究发现,LXA4和NPD1两种SPM皆能调控RD1小鼠视网膜和大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞的激活与功能来缓解其介导的炎症反应,从而改善退行性病变视网膜的微环境,间接保护视网膜神经细胞。3.本研究观察到,LXA4和NPD1两种SPM皆具有减少退行性病变视网膜中神经细胞凋亡的作用。LXA4降低RD1小鼠变性晚期视网膜中感光细胞的凋亡并维持外核层的厚度,挽救视网膜电生理功能。NPD1减少NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC的凋亡并维持其电生理反应。4.本课题创新性地利用视网膜外植体培养技术,在组织水平上离体研究了SPM对于退行性病变视网膜中炎症反应的调控作用,并证实LXA4显著降低RD1小鼠变性晚期视网膜中CCL-2的产生与分泌。这明确了LXA4对小胶质细胞激活的抑制作用是其限制退行性病变视网膜炎症的重要机制。5.本课题率先报道在NMDA损伤视网膜大鼠模型的视网膜中calpains参与的RGC凋亡途径,并发现外源性NPD1通过降低NMDA损伤大鼠视网膜calpain 1的表达来发挥其对RGC的抗凋亡作用。这为延缓视网膜退行性疾病中进行性的神经细胞变性和凋亡提供了新的干预靶点。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R774.1
【部分图文】：

图 2-2 开放明场实验示意图（2）实验步骤：RD1小鼠暗适应过夜；安装开放明场实验设备（图2-2），确保白箱底部光强度为300lx；在暗适应条件下，RD1小鼠先分别放入黑箱、白箱适应2min后，将小鼠置于白箱底部正中。当置于顶部的录相机开始记录时，同时开灯并打开黑白箱中间的孔洞，记录5min内小鼠在黑、白箱之间往返的行为。在进行下一只小鼠实验前，充分清洁黑白箱。最后统计各小鼠待在黑箱中的时间以评估其视功能。7. 视网膜外植体培养视网膜外植体培养技术已被广泛用于体外研究视网膜发育、神经变性和神经死亡等过程及探寻有效的神经保护，细胞移植等治疗策略[42]。将PN13的RD1小鼠的视网膜完整分离出，并置于transwell膜上培养于12孔板中。培养基为含有1% N2, 2% B27, 0.8 mML-Glutamine和1%青霉素/链霉素的Neurobasal神经培养基。培养过夜后

1. LXA4 维持 RD1 小鼠视功能作用的研究(1) LXA4 合成限速酶和受体在视网膜变性过程中表达水平的变化在研究 LXA4 对视网膜退行疾病进展的影响作用之前，我们首先进行 RT-PCR 评估RD1 小鼠视网膜组织中 Alox5，Alox15 和 Fpr2（分别为 5-LOX，15-LOX 和 ALX/FPR2的小鼠直系同源物）的表达水平变化。与变性前期（PN7）相比，在变性高峰期（PN14）时三种基因的 mRNA 表达水平皆上调，且具有显著的统计学意义（图 2-3）。然而，与PN14 相比，在变性晚期（PN21）RD1 小鼠视网膜中 Alox15 和 Fpr2 表达的显著降低（p<0.0001）（图 2-3B，C），其中 Fpr2 在 PN21 的表达低于 PN7 的表达（p <0.05）。而 PN21时 RD1 小鼠视网膜的 Alox5 的 mRNA 水平却持续升高，较 PN7 时有明显统计学差异（p<0.01）。鉴于 5-LOX 在炎症介质白三烯生物合成中的关键作用[43]，Alox5 的上调提示变性视网膜中炎症反应逐渐加重。以上数据提示，LXA4 合成限速酶和受体在视网膜变性期间先上调，而后在变性末期显著降低。这一结果为进一步研究外源性 LXA4 对视网膜退行疾病进展的影响奠定了基础。

LXA4 处理使 RD1 小鼠维持较好的视觉行为小鼠在暗室活动的时间统计(n=5)。结果采用双数据表示为平均值±标准误，* p <0.05，** p 开放明场实验中 RD1 小鼠在暗室活动的时（Sidak 多重比较, x±s, n=5, s）PN15 PN18 192.80 ±27.12 86.40 ±6.59 240.60 ±22.44 148.60 ±15.51 2.03 2.64 0.15 0.04 鼠视功能维持作用的机制研究1 小鼠视网膜中感光细胞的凋亡
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本文编号：2892810