Ca 2+ /Calpain/CDK5信号通路对耳毒性耳聋模型大鼠毛细胞死亡的调控作用

发布时间：2020-12-10 09:01

　　目的：探讨CDK5/P35在耳蜗组织的空间表达情况，以及在耳毒性模型中是否通过激活周期素依赖性蛋白激酶5（Cyclin Dependent Kinase-5, CDK5）信号通路而引起耳蜗内毛细胞损伤，从而导致耳聋的发生，以期对该通路诱发的耳聋的干预。方法：首先用免疫荧光组织化学法、Western Blot、PCR的方法同时证实了在大鼠耳蜗内毛细胞确实存在CDK5及其激活剂P35的表达。急性毛细胞体外给药检测硫酸卡那霉素是否造成毛细胞内钙浓度的上调而引起钙超载。在此基础上，利用体外培养的耳蜗毛细胞耳毒性损伤模型，以出生后4天乳大鼠耳蜗基底膜分离进行体外培养，收集蛋白，Western Blot检测各时间点细胞死亡的上游分子Calpain以及CDK5与P35的变化。体外培养耳蜗毛细胞随机分为3组：空白对照组，硫酸卡那霉素处理组，硫酸卡那霉素加Roscovitine组，各组同时培养8h，后进行PI染色，观察细胞死亡的水平。结果：1.在大鼠耳蜗毛细胞中，螺旋器部分CDK5/P35的免疫荧光组织化学、WesternBlot、PCR、体外激酶反应结果均呈阳性；2.体外急性给予KM会导致耳蜗毛细胞内... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

钙超载激活Calpain/CDK5/P35信号通路

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文4．实验动物成年 SD 大鼠及出生后 4 天 SPF 级乳大鼠均由华中科技大学同济医学院动物实中心提供。5．实验方案设计及主要实验方法5.1 实验方案具体设计如下图所示（图 1）：CDK5 参与调控耳毒性药物引起的耳蜗毛细胞

图 2. 基底膜铺片法荧光双标将组织切片在室温干燥 20min（基底膜铺片法可省去此步）；PBS-0.1% Triton X-100 室温缓慢振摇 30min；弃去前液，用 10%羊血清室温封闭 1 h (不含 NaN3，用 PBS一抗 4℃孵育 24-48h (3%羊血清稀释)；恢复室温后，PBST 缓慢振摇漂洗 10min x 3；二抗室温孵育 1 h (避光)，PBST 振摇漂洗 10min x 3；换孵第二种二抗，室温避光孵育 1 h, PBST 振摇漂洗 10mi


本文编号：2908435