利用CRISPR/Cas9技术对绿色荧光报告基因人诱导多能干细胞系的构建

发布时间：2021-03-01 19:20

　　目的构建表达视觉系统同源框2（VSX2）增强绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的人诱导多能干细胞系（hiPSCs）。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术原理,设计VSX2的小向导RNA（sgRNA）,构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒;2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系,采用嘌呤霉素筛选获得单克隆,扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型;采用核型分析法分析报告细胞系核型;采用STR法排除细胞交叉污染;采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达;通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力;应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官,并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明,BC1-VSX2eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明,BC1-VSX... 

【文章来源】：中华实验眼科杂志. 2020,38(10)北大核心

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本文编号：3057915