Fgf22基因在小鼠听觉传导通路中的作用及机制研究

发布时间：2021-03-02 00:41

　　目的:目前听力损失是影响全球人类健康的重要原因之一,据2013年世界卫生组织（The Word Health,WHO）数据调查结果显示,目前全世界听力障碍患者大约有36,000万,约占总人口的5.3%,其中15岁以下听障患儿约有3,200万。根据病因可以将听力损失分为先天性和后天性两种,其中先天性听力损失主要包括遗传性聋,而后天性听力损失主要包括噪声诱导的听力损失、耳毒性药物诱导的听力损失以及老年性聋等。因此,尽早完善与听力损失相关的基因突变谱,并通过基因筛查与诊断提早进行患病风险的评估和预防,将对最终降低我国人口听力损失发病率、提高人口质量具有重大意义。不论是先天性还是后天性,导致最终听力损失的原因都是阻断了声音在听觉传导通路的正常传递。听觉传导通路主要分为外周听觉传导通路和中枢传导通路,其中外周听觉系统传导通路为:外界声音从外耳道通过鼓膜,将声音传递至中耳,再通过听小骨振动将声音信号放大并传递至卵圆窗,并通过淋巴液的振动传递刺激耳蜗Corti器。中枢神经系统正常传导通路为:耳蜗Corti器中的外毛细胞接受到刺激之后将声音信号放大,刺激内毛细胞将声音信号通过突触进行编码,然后沿着耳蜗... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

Fgf22基因信息图

中国医科大学博士学位论文11图1.2共聚焦显微镜下带状突触数量计数示意图a-c.耳蜗内毛细胞带状突触前后膜蛋白标记结果，提示正常突触信号存在于内毛细胞底部；d-e.沿z轴层扫突触带模式图，扫描层距为0.35μm；e.空间分布下突触带沿着z轴扫面的分布情况；f.将全耳蜗所有扫描结果叠加后，合成3D示意图(引自keliuetal.Molneurobiol.2013)；（3）激光共聚焦显微镜成像：将标本置于激光共聚焦显微镜（德国Leica公司TCSSP5II）下观察，采用10×目镜和63×油镜分别观察，激发光波长分别使用358nm和488nm。成像过程中沿着从顶回向底回方向依次扫描，相邻两个扫描区域以大约10个毛细胞的间距分隔开，再连续观察每一个层的图像，并叠加各层的最大灰度值，最后使全部信号在都叠加在同一层面上，从而便于突触数量的观察与计数，本实验设定的扫描层距为0.35μm；（4）耳蜗带状突触数目计数以及定位：首先将激光共聚焦显微镜扫描的耳蜗图片从顶回向底回按照扫描的顺序进行编号（eg:n=0、1、2、3……、m），然后分别计数突触后绿色荧光和突触前红色荧光通道所示信号，并运用ImageJ软件计数，对每一幅图片所得信号总数除以毛细胞的总数目，也就得到了这个区域中单个毛细胞对应的突触数量。

中国医科大学博士学位论文13图1.3将Cas9及sgRNA显微注射进入受精卵构建Fgf22基因缺陷模型A.准备显微注射进入受精卵；B.正在进行显微注射进入受精卵（图片由徐州医科大学动物中心提供）；2.4.8Fgf22基因敲除小鼠基因型鉴定（1）提取鼠尾DNA组织1）首先剪取鼠尾组织0.5-1cm,放入无酶EP管中，加入200-300μl缓冲液GA,随后溶解液中再加入20μlProteinaseK溶液；2）在56℃水浴锅中消化过夜，直至所有的团块都全部消失；3）随后加入200μl缓冲液GB，上下充分颠倒混匀，70℃烤箱内放置10分钟，待溶液应变清亮，轻度离心以去除管盖内壁的水珠；4）随后每个EP管中加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀大约15秒，此时可能会出现絮状沉淀物，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5）此时需要将上一步所得溶液和絮状沉淀全部都倒入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），进行12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，随后倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；6）再向吸附柱CB3中加入500μl的缓冲液GD，进行12,000rpm(~13,400×g)离心30秒之后倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；7）随后向吸附柱CB3中加入600μl的漂洗液PW，进行12,000rpm(~13,400×g)离心30秒后，倒掉上层废液，然后将吸附柱CB3放入到收集管中；8）重复步骤7；9）然后将吸附柱CB3放再放置于收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟后，倒掉废液，再将吸附柱CB3在常温下放置3-5分钟；10）然后将上一步骤中的吸附柱CB3转移到一个干净无菌的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl左右的洗脱缓冲液TE，室温放置大约3-5min后，进行12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，最后将溶液收集到离心管中；


本文编号：3058268