Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达及调控突触囊泡胞吐的实验研究
发布时间：2017-04-21 10:03
本文关键词：Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达及调控突触囊泡胞吐的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：随着老龄化社会的发展,听障人口逐年增加,感音神经性耳聋(sensorineural hearing loss,SNHL)已成为目前人类面临的主要健康问题之一[1],也是耳鼻喉科专科疾病治疗的重点和难点。虽然近期有大量关于SNHL发病病理[2]、毛细胞再生、支持细胞、干细胞转化治疗等相关研究报道,但其发病机制和治疗仍然面临着巨大的挑战[3]。SNHL可细分为感音性和神经性[4],内毛细胞(inner hair cells,IHCs)的突触是外界声刺激通过听觉神经传递至听觉中枢的第一站,若其发生病变,将导致IHCs声刺激-电信号转换障碍,而引起耳蜗感音性受损,但因两者临床表现极其相似,临床上无法严格区分。IHCs能够将不同频率、响度的声音不知疲倦地转换成瞬息、精确、分级的谷氨酸递质释放,来激活突触后受体产生动作电位。IHCs的突触不同于传统神经突触,在电镜下呈“带状”,称为带状突触,主要构成蛋白为Ribeye/CtBP2[5,6],周围捆绑大约70-200个囊泡,缩短了囊泡与细胞膜的距离,形似“运输带”一样,能够源源不断地将装配好的囊泡运输到突触前活化位点,促进囊泡同步释放,来维持IHCs持续分泌神经递质,以应对各级声刺激。对IHCs突触蛋白构成的进一步研究发现,其与传统的神经元突触有很大的不同,比如synaptotagmins 1-2、complexins、Munc13-1等传统神经元必需的突触蛋白[7-9],而在IHCs中是缺失的,且雇佣了特殊的蛋白Vglut3、otoferlin等参与突触执行功能[10-12]。IHCs与听神经之间的信息交流和大多数化学突触一样的,在IHCs胞内,神经递质被包装到突触囊泡(synaptic vesicles,SVs)内,当动作电位来临时,激活并打开突触前电压门控Ca2+通道,Ca2+触发胞吐,递质释放到突触间隙激活听神经末梢相应受体从而产生神经冲动传递的。突触胞吐主要包括两个步骤:SV铆钉和与突触前膜的融合。SV铆钉是指囊泡吸附到胞膜活化区,SVs在融合之前需要预准备即启动,然后Ca2+触发融合孔道开放完成融合[13]。胞吐的最终阶段即SVs的膜融合成为了递质分泌的重要前提[13,14]。研究表明SVs胞吐需要许多进化保守的蛋白参与整个过程的一系列步骤,其中主要有[15-17]:SNARE蛋白synaptobrevin、syntaxin-1和SNAP-25形成SNARE复合体,负责将囊泡和细胞质膜粘贴在一起促进融合;Munc18-1同时与“关闭”构象的syntaxin-1和snare复合体衔接调控上述四种蛋白的装配[18];及ca2+敏感蛋白synaptotagmin-1启动融合。munc18-1是sec1/munc18(sm)蛋白家族的成员,约60-70kda多肽氨基酸链,包含3个结构域,形成含有中央腔隙的拱桥形,“关闭”构象的syntaxin-1即位于其中央区[16]。关于munc18-1功能的报道目前主要包括:作为syntaxin-1的伴侣分子,协助其正确的定位和表达[18-20];启动或促进snare蛋白参与的胞吐过程[21-23];辅助大而拥有致密核心的囊泡铆钉到邻近的细胞膜[24]。近年通过对体外脂质体融合试验的研究[25]发现,膜融合起始于munc18-1-syntaxin-1二聚体的形成,且已有报道证实了敲除munc18-1基因后,突变小鼠中枢神经元及神经肌肉接头的突触彻底失去了分泌神经递质的能力[26],蛋白激酶c(proteinkinasec,pkc)能够使munc18-1的ser-313位点磷酸化而促进嗜铬细胞分泌[27],并且munc18-1在神经元末梢的募集反应受pkc影响,在中枢神经递质分泌短时程增强过程中munc18-1受pkc动态调控[28,29],可见munc18-1是svs胞吐的关键蛋白,且受胞内pkc磷酸化的影响。虽然针对munc18-1蛋白的研究已有很多报道,但目前大部分局限于嗜铬细胞、pc12细胞、中枢神经元,而关于ihcs突触囊泡胞吐的研究相对较少。研究者通过比较ihcs、视网膜和中枢神经的突触后发现ihcs中也有munc18-1、syntaxin-1、snare等蛋白的表达[30],但munc18-1在胞内具体的分布、定位并没有详细的阐明,且其在ihcs中是否同样起到调控svs的胞吐,与听觉的发育有无关系仍不清楚。我们知道细胞膜是由具有绝缘性的脂质双分子层构成,于是胞外液-膜-胞内液即形成膜电容(membranecapacitance,cm)[31],cm=πd2/100(pf),d=细胞的直径(μm),与细胞膜的表面积成正比。刺激ihcs胞吐的过程中,必需囊泡与突触前膜融合,递质才能通过融合孔道释放到突触间隙,融合的同时胞膜的表面积即相应增大,伴随着cm也增大。而电生理膜片钳技术能够实时监测cm,已成为研究ihcs胞吐的重要手段[6,32,33]。本实验首先通过免疫荧光标记、激光共聚焦成像技术,分别检测成年小鼠耳蜗ihcs中munc18-1的表达、定位及其同带状突触ribeye/ctbp2的关系;其次通过实时荧光定量qrt-pcr检测,比较出生后第6、12、18天(p6、p12、p18)的小鼠耳蜗munc18-1基因的相对表达变化,观察munc18-1与听力成熟的关系;最后采用电生理膜片钳技术,观察抑制和激活内源性pkc介导munc18-1的磷酸化对急性分离的ihcs钙电流(ica)、cm的影响,对munc18-1调控ihcs突触囊泡分泌的作用做初步的探讨。结果:1、激光共聚焦检测发现,munc18-1荧光标记显示在ihcs胞质中有高浓度的表达,munc18-1与ctbp2双标提示munc18-1蛋白主要在核下区及ctbp2周围,核下区Munc18-1的IMV值强于核上区,P0.05有差异;2、实时荧光定量q RT-PCR检测发现,P6、P12、P18三个年龄段的小鼠耳蜗Munc18-1蛋白的表达量无差异,P0.05无统计学意义;3、膜片钳全细胞电压钳技术检测发现,IHCs给予PKC抑制剂作用后的动作电位发放频率(APf)较对照组(给药前)减少,P0.05有差异;同时作用后的膜电容变化量(△Cm)较之前减小,P0.05;接着再给予PKC激动剂作用于IHCs后发现APf较之前2组(对照组、PKC抑制剂组)均增多,△Cm增大,P0.05有统计学意义。结论:本研究表明:内毛细胞中有Munc18-1蛋白表达,且聚集在核下区、带状突触附近;Munc18-1蛋白是IHCs突触囊泡胞吐不可或缺的蛋白,未成熟IHCs中即有表达,但与听力发育的关系还需进一步验证;通过抑制和激动PKC发现对IHCs的AP发放频率及膜电容有影响,可能是通过内源性PKC介导Munc18-1的磷酸化来影响IHCs突触囊泡的胞吐。
【关键词】：Munc18-1蛋白 Ct BP2蛋白 内毛细胞 PKC 电生理
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.35
【目录】：
- 缩略语表4-6
- 英文摘要6-10
- 中文摘要10-13
- 第一章 前言13-17
- 第二章 Munc18-1 蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达17-24
- 2.1 材料与方法17-19
- 2.2 实验结果19-21
- 2.3 讨论21-23
- 2.4 小结23-24
- 第三章 Munc18-1 蛋白与小鼠听力发育相关性的实验研究24-30
- 3.1 材料与方法24-27
- 3.2 实验结果27-28
- 3.3 讨论28-29
- 3.4 小结29-30
- 第四章 PKC介导的Munc18-1 磷酸化对内毛细胞突触囊泡胞吐的影响30-41
- 4.1 材料与方法31-34
- 4.2 实验结果34-38
- 4.3 讨论38-40
- 4.4 小结40-41
- 全文结论41-42
- 参考文献42-50
- 文献综述Munc18-1 蛋白调控突触囊泡胞吐的研究进展50-63
- 参考文献58-63
- 攻读学位期间发表论文63-64
- 致谢64-65
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 唐s，
本文编号：320069
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/wuguanyixuelunwen/320069.html
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