Dvl家族在斑马鱼侧线毛细胞再生调控中的作用
发布时间：2021-12-02 18:09
成体哺乳动物的内耳无法再生毛细胞。人的毛细胞一旦受损或死亡便会造成永久性的听觉和平衡觉的功能异常,甚至会导致个体失聪、失衡。但是自然界中鸟类、两栖类和硬骨鱼类等非哺乳类脊椎动物的内耳及侧线等感觉系统却能终生再生毛细胞。因此,研究这些非哺乳动物的毛细胞再生机制,将有助于我们了解哺乳动物无法修复内耳毛细胞损伤的内在原因,进而帮助寻找诱导毛细胞再生的治疗手段。本课题以斑马鱼侧线神经丘为研究对象,从一个侧线毛细胞发育正常但再生异常的突变体sim1begfp Et入手,利用胚胎活体成像、实时荧光定量PCR、显微注射、基因编辑、免疫共沉淀等技术探讨该突变体在顺铂损伤后,侧线再生毛细胞异常的遗传机制。本文研究发现:Sim1b可直接结合部分Disheveled家族成员的调控区域进而调控Wnt信号通路活性。其中,Sim1b正向调控dvl3a的表达,促进β-catenin在细胞核中富集,进而开启前体细胞的增殖和分化,促进毛细胞的再生。与之相反,我们发现Sim1b负向调控dvl2和dixdc1b的表达。由于Sim1b在神经丘中的表达起始于侧线发育基本完成之后,因此sim1be...
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼侧线神经丘的遗传标记（图片改编于Raible实验室[49]）
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-11-sim1b是含有bHLH结构域的转录因子，可以通过结合DNA来调控相关基因的表达。在神经丘中表达最早可以追踪到3dpf（图1-8），在此之前sim1b表达主要集中于头部，并不在后侧线神经丘中，这可能是它不影响侧线毛细胞发育的原因之一。在此研究基础上进行了损伤后神经丘细胞的RNA-seq实验，发现Wnt信号通路下游关键因子dvl3a的表达相较于野生型有显著的下降。另外，dvl3a在斑马鱼心脏和视网膜再生过程中均随着时间表达升高。所以我们猜测dvl3a可能参与到后侧线毛细胞的再生过程之中并且是调控斑马鱼侧线毛细胞再生的关键步骤。同时本文将对sim1begfpEt突变体影响侧线毛细胞的再生机制进行初步探讨。sim1begfpEt突变体可以帮助我们初步证实了再生与发育为截然不同的生命现象，以此为切入点可以帮助阐释发育与再生之间的内在差别。另外，研究斑马鱼后侧线毛细胞的再生不仅可以为因毛细胞损伤造成的听觉、平衡觉功能障碍的治疗和遗传检测提供理论基础，还可以向毛细胞相关研究方向提出新的问题并在临床上帮助提出新的治疗策略。图1-8sim1b在3dpf胚胎中的表达图谱
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-28-3.2dvl3a表达降低斑马鱼侧线毛细胞再生异常我们将0.5mM的dvl3a-MO（序列为：5’-AACTTTAGTCTCCCCCATTGCAGAC-3’）和Randomcontrol-MO（序列为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’）分别在胚胎处于单胞期时将1nL的MO注射入卵黄中，随后将胚胎置于28.5℃恒温培养。如前文所述，5pdf的幼鱼的后侧线系统已经发育成熟，所以我们选择用5pdf的幼鱼进行后侧线毛细胞的再生实验（本文实验采用的均为5dpf的幼鱼，后文中将不再赘述）。斑马鱼幼鱼的后侧线毛细胞损伤系统采用0.5mM的顺铂避光浸泡处理6小时。分别在顺铂处理前（5dpf）以及顺铂处理后0h（0hpt）、12h（12hpt）、24h（24hpt）、48h（48hpt）用毛细胞特异性小分子活体染色剂YO-PRO-1室温避光孵育30分钟，随后用ZEISSA2显微镜观察毛细胞的再生情况，统计后侧线系统中前三个神经丘中新生毛细胞的数目。实验结果呈现如下：注射dvl3a-MO与Randomcontrol-MO胚胎死亡率以及畸形率均没有显著差异。其中，斑马鱼幼鱼胚胎中的后侧线系统的发育也没有显著的异常，每个神经丘中约含有13-14个毛细胞（图3-3所示），并呈花环状结构排列在躯体的两侧，每一侧平均形成7-8个成熟的神经丘（图3-2所示）。在顺铂处理后0hpt（hoursposttreatment）的实验结果中我们可以推断：0.5图3-25dpf斑马鱼后侧线系统。在dvl3a-MO与controlMO的5dpf的胚胎中，斑马鱼的后侧线系统可以正常发育。YO-PRO-1用于标记斑马鱼的侧线毛细胞。
【参考文献】：
期刊论文
[1]无义突变与“遗传补偿效应”[J]. 马志鹏,陈军. 遗传. 2019(05)
[2]Wnt/β-catenin的表达与肿瘤关系研究进展[J]. 李国栋,姚碧辉,金文海,梁鲁. 世界最新医学信息文摘. 2018(07)
[3]哺乳动物前庭毛细胞再生的研究进展[J]. 徐金操,杨仕明,黄德亮. 听力学及言语疾病杂志. 2008(05)
本文编号：3528922
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼侧线神经丘的遗传标记（图片改编于Raible实验室[49]）
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-11-sim1b是含有bHLH结构域的转录因子，可以通过结合DNA来调控相关基因的表达。在神经丘中表达最早可以追踪到3dpf（图1-8），在此之前sim1b表达主要集中于头部，并不在后侧线神经丘中，这可能是它不影响侧线毛细胞发育的原因之一。在此研究基础上进行了损伤后神经丘细胞的RNA-seq实验，发现Wnt信号通路下游关键因子dvl3a的表达相较于野生型有显著的下降。另外，dvl3a在斑马鱼心脏和视网膜再生过程中均随着时间表达升高。所以我们猜测dvl3a可能参与到后侧线毛细胞的再生过程之中并且是调控斑马鱼侧线毛细胞再生的关键步骤。同时本文将对sim1begfpEt突变体影响侧线毛细胞的再生机制进行初步探讨。sim1begfpEt突变体可以帮助我们初步证实了再生与发育为截然不同的生命现象，以此为切入点可以帮助阐释发育与再生之间的内在差别。另外，研究斑马鱼后侧线毛细胞的再生不仅可以为因毛细胞损伤造成的听觉、平衡觉功能障碍的治疗和遗传检测提供理论基础，还可以向毛细胞相关研究方向提出新的问题并在临床上帮助提出新的治疗策略。图1-8sim1b在3dpf胚胎中的表达图谱
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-28-3.2dvl3a表达降低斑马鱼侧线毛细胞再生异常我们将0.5mM的dvl3a-MO（序列为：5’-AACTTTAGTCTCCCCCATTGCAGAC-3’）和Randomcontrol-MO（序列为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’）分别在胚胎处于单胞期时将1nL的MO注射入卵黄中，随后将胚胎置于28.5℃恒温培养。如前文所述，5pdf的幼鱼的后侧线系统已经发育成熟，所以我们选择用5pdf的幼鱼进行后侧线毛细胞的再生实验（本文实验采用的均为5dpf的幼鱼，后文中将不再赘述）。斑马鱼幼鱼的后侧线毛细胞损伤系统采用0.5mM的顺铂避光浸泡处理6小时。分别在顺铂处理前（5dpf）以及顺铂处理后0h（0hpt）、12h（12hpt）、24h（24hpt）、48h（48hpt）用毛细胞特异性小分子活体染色剂YO-PRO-1室温避光孵育30分钟，随后用ZEISSA2显微镜观察毛细胞的再生情况，统计后侧线系统中前三个神经丘中新生毛细胞的数目。实验结果呈现如下：注射dvl3a-MO与Randomcontrol-MO胚胎死亡率以及畸形率均没有显著差异。其中，斑马鱼幼鱼胚胎中的后侧线系统的发育也没有显著的异常，每个神经丘中约含有13-14个毛细胞（图3-3所示），并呈花环状结构排列在躯体的两侧，每一侧平均形成7-8个成熟的神经丘（图3-2所示）。在顺铂处理后0hpt（hoursposttreatment）的实验结果中我们可以推断：0.5图3-25dpf斑马鱼后侧线系统。在dvl3a-MO与controlMO的5dpf的胚胎中，斑马鱼的后侧线系统可以正常发育。YO-PRO-1用于标记斑马鱼的侧线毛细胞。
【参考文献】：
期刊论文
[1]无义突变与“遗传补偿效应”[J]. 马志鹏,陈军. 遗传. 2019(05)
[2]Wnt/β-catenin的表达与肿瘤关系研究进展[J]. 李国栋,姚碧辉,金文海,梁鲁. 世界最新医学信息文摘. 2018(07)
[3]哺乳动物前庭毛细胞再生的研究进展[J]. 徐金操,杨仕明,黄德亮. 听力学及言语疾病杂志. 2008(05)
本文编号：3528922
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/wuguanyixuelunwen/3528922.html
最近更新
教材专著
