miR-17-5p在低氧环境下影响颏舌肌肌卫星细胞线粒体功能的初步研究

发布时间：2017-05-31 12:18

  本文关键词：miR-17-5p在低氧环境下影响颏舌肌肌卫星细胞线粒体功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征发生的根本原因在于睡眠期间发生反复,部分或完全的上气道阻塞。上气道阻塞与否主要取决于两大因素:解剖结构和上气道扩张肌张力。颏舌肌是最重要的上气道扩张肌之一,其功能异常可以导致上气道的陷闭,甚至呼吸暂停。维持颏舌肌功能正常的基础是其线粒体能量代谢的平衡。有研究显示,OSAHS患者由于肌纤维类型发生变化,维持颏舌肌张力的产能方式向能量代谢效率较低的糖酵解型转变,其副产物乳酸的增加使肌肉组织更易疲劳,加重了上气道阻塞的程度。然而,这一线粒体能量代谢过程对低氧环境的适应非常复杂,其具体机制尚不清楚。有研究者发现,mi RNAs可以从转录后水平精确的调控线粒体功能,低氧调控mi RNAs的出现使研究者们开始注意到这些发生改变的mi RNAs可以在低氧环境下调控细胞能量代谢水平,从而可能实现对线粒体功能的恢复甚至增强。因此,本研究结合课题组前期研究结果及国内外文献,拟探讨mi R-17-5p与颏舌肌及线粒体功能之间的关系,从而达到揭示miRNAs治疗能量代谢异常所致的肌肉功能减退性疾病的分子生物学机制,为OSAHS的临床治疗提供更多的理论依据。方法1.应用改良间歇性低压氧装置建立SD大鼠低氧动物模型,通过腹主动脉血血气分析进行模型评定。2.通过he染色、atp酶组织化学染色及透射电镜观察的方法检测低氧对颏舌肌能量代谢能力的影响。3.应用酶消化的方法分离培养大鼠颏舌肌肌卫星细胞(genioglossusmusclesatellitecells,ggmuscs);采用差速贴壁技术进行细胞纯化;通过免疫荧光染色技术鉴定细胞纯度。4.通过rt-pcr反应比较低氧与常氧动物模型mir-17家族表达量变化,筛选目标mir-17;通过在不同低氧时间下检测mir-17-5p相对表达量,进行mir-17-5p作用敏感时间的筛选。5.应用瞬时转染技术上调、下调mir-17-5p,进行实验分组;通过mtt比色法、流式细胞术检测各组ggmuscs增殖及凋亡。6.通过以下三个方面检测上调、下调mir-17-5p后对ggmuscs线粒体功能的影响:采用透射电镜观察细胞线粒体超微结构;应用线粒体膜电位荧光探针检测各组跨膜电位不同;通过激光共聚焦显微镜动态观察各组ca2+转运变化。7.通过生物信息学分析软件预测mir-17-5p与线粒体功能相关的靶基因;通过rt-pcr及westernblot检测靶基因mrna及蛋白水平变化,进行靶基因的初步确定。结果1.间歇性低氧模型建立成功,血气分析结果显示低氧模型组sd大鼠血氧饱和度及氧分压较对照组显著降低(p0.05)。2.he染色、atp酶组织化学染色显示:低氧组大鼠颏舌肌Ⅱ型肌纤维较对照组增多,提示其能量代谢方式向产能效率低的糖酵解型转变;经透射电镜观察发现:低氧组大鼠颏舌肌肌纤维间线粒体数量减少,线粒体水肿,嵴断裂;以上结果均提示低氧组大鼠颏舌肌线粒体能量代谢功能受到损伤。3.倒置显微镜下观察到ggmuscs分化成肌管后呈现节律性收缩;细胞免疫荧光染色结果显示骨骼肌特异性肌球蛋白染色呈阳性,阳染细胞比例大于95%,表明所培养的ggmuscs纯度高,可以应用于后续的实验。4.通过rt-pcr检测mir-17家族在低氧模型组中表达量,确定mir-17-5p为本实验研究目标;比较不同低氧时间mir-17-5p表达量变化,确定低氧12h为mir-17-5p作用敏感时间。5.MTT、流式细胞术检测结果显示:低氧组与常氧组相比,细胞活性下降,凋亡率升高,表明低氧造成了细胞损伤;在转染anti-miR-17-5p的低氧组细胞,其细胞活性较低氧组降低,凋亡率较低氧组上升,表明抑制miR-17-5p对细胞产生了一定的损害;在转染pre-miR-17-5p的低氧组细胞,其细胞活性有所恢复,凋亡率较低氧组下降,表明上调miR-17-5p对细胞有一定的保护作用。6.通过研究各组细胞线粒体超微结构、膜电位水平及Ca2+转运这三个与线粒体功能密切相关的指标,本实验发现低氧组线粒体结构出现线粒体嵴断裂等明显损伤,线粒体功能受损,其膜电位势能较低,Ca2+滞留;在转染anti-miR-17-5p的低氧组细胞,其超微结构损伤与低氧组无异,但溶酶体吞噬线粒体现象增多,线粒体膜电位势能降低,初始钙滞留浓度较低氧组有所上升,表明抑制miR-17-5p对线粒体功能产生了伤害;在转染pre-miR-17-5p的低氧组细胞,其超微结构损伤程度减轻,线粒体膜电位势能有所恢复,初始钙滞留浓度下降,表明上调miR-17-5p对线粒体有一定的保护作用。7.通过生物信息学分析、RT-PCR及Western Blot检测发现,线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因与蛋白水平变化与miR-17-5p的变化趋势相反,提示Mfn2可能是mi R-17-5p作用于线粒体功能的靶基因。结论1.通过改良间歇性低压低氧装置可以有效的建立OSAHS低氧动物模型。2.低氧能够造成颏舌肌线粒体病理性水肿,肌纤维结构受损,颏舌肌能量代谢方式改变。3.应用酶消化+差速贴壁技术可以有效获得颏舌肌肌卫星细胞。4.上调miR-17-5p对颏舌肌肌卫星细胞线粒体功能有一定的保护作用。5.Mfn2可能是miR-17-5p作用于线粒体功能的靶基因。
【关键词】：阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 间歇性低氧动物模型 颏舌肌 mi R-17-5p 线粒体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R766
【目录】：

• 缩略语表3-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-29
• 第一部分 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征14-20
• 第二部分 低氧与 OSAHS 的联系20-22
• 第三部分 颏舌肌与 OSAHS 的联系22-26
• 第四部分 低氧 mi RNAs 与颏舌肌能量代谢26-29
• 第一部分 低氧影响颏舌肌功能的动物实验29-39
• 1 材料29-30
• 2 方法30-33
• 3 结果33-37
• 4 讨论37-39
• 第二部分 大鼠颏舌肌肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及低氧mi R175p的确定39-51
• 1 材料39-40
• 2 方法40-45
• 3 结果45-49
• 4 讨论49-51
• 第三部分mi R175p对颏舌肌肌卫星细胞线粒体功能的影响及其靶基因的初步探索51-66
• 1 材料51-52
• 2 方法52-56
• 3 结果56-63
• 4 讨论63-66
• 全文总结66-67
• 参考文献67-74
• 研究成果74

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本文编号：409469